骨髓间充质干细胞移植对脑缺血大鼠Notch1-Dll4信号通路的影响

作者单位：1 350000福建医科大学附属第三医院神经内科；2 350000福建国际旅行卫生保健中心



骨髓间充质干细胞移植对脑缺血大鼠Notch1-Dll4信号通路的影响

林菲菲1熊慧玲2

作者单位：1 350000福建医科大学附属第三医院神经内科；2 350000福建国际旅行卫生保健中心

【摘要】目的 探讨骨髓间充质干细胞移植对大鼠脑缺血后Notch1-Dll4信号通路的影响。方法 60只SD大鼠随机分为假手术组，MCAO组，BMSC组，DAPT组。制备大鼠MCAO模型，BMSC组及DAPT组分别于造模成功后24 h经侧脑室注入BMSCs或含DAPT的BMSCs，术后4 d、7 d、14 d取脑，计数脑缺血周边区微血管数量，RT-PCR法检测Notch1、Dll4的表达。结果 BMSC组大鼠脑缺血周边区的微血管数量明显多于MCAO组及DAPT组（P＜0.05）；BMSC组大鼠Notch1、Dll4表达水平较MCAO组及DAPT组明显增高（P＜0.05）。结论 骨髓间充质干细胞移植可能通过上调Notch1-Dll4信号通路的表达来促进大鼠脑缺血周边区血管新生。

【关键词】脑缺血；骨髓间充质干细胞；Notch1

骨髓间充质干细胞（BMSCs）可能通过促进血管新生来改善脑缺血大鼠神经功能［1］，在血管新生过程中，VEGF对血管发育的启动至关重要，而Notch1-Dll4信号通路可通过抑制新生血管过量芽生，促进新生血管网的正常构建［2］，本研究予骨髓间充质干细胞移植干预脑缺血大鼠，检测脑组织中新生血管情况及Notch1-Dll4信号通路表达情况，进一步探讨BMSCs促进脑缺血大鼠神经功能恢复的机制。

1　主要材料

清洁级成年雄性SD大鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司；L-DMEM培养基、胎牛血清为GIBIC0公司产品；兔抗人Ⅷ因子多克隆抗体购自福州迈新生物技术开发有限公司。

2　方法

2.1 SD大鼠BMSCs细胞的分离培养

取体重60～80 g的清洁级雄性SD大鼠，分离两侧股骨，暴露骨髓腔，反复冲洗，将骨髓悬液过滤并离心后，弃上清，重悬细胞后移至培养瓶中，置于培养箱内培养，24 h后去除未贴壁细胞，更换培养液，后每3 d换液1次，原代细胞生长融合至80% ～90%时行传代培养，取第3代细胞进行移植。

2.2 实验动物分组及干预

60只雄性清洁级成年SD大鼠，体重200～250 g。随机分为Sham组、MCAO组、BMSC组、DAPT组，每组15只，线栓法制备MCAO模型，BMSC组于造模成功后24 h经侧脑室注射30 µl含l×106个细胞的细胞悬液，DAPT组于造模成功后24 h经侧脑室注射30 µl含有γ分泌酶抑制剂（DAPT，Notch信号通路特异性抑制剂，浓度为50 ug/m1）的BMSCs悬液。各组再按不同时间点随机分成3组，每组5只，术后4 d、7 d、14 d取材。

2.3 微血管密度（microvessel density，MVD）检测

冰冻切片标本予兔抗人Ⅷ因子抗体行免疫荧光染色。按Weidner等［3］方法行MVD计数，每单个内皮细胞或内皮细胞簇为一个血管计数，每个标本取2～3张切片，每张切片在低倍镜下选择同一皮质缺血周边区的5个血管内皮细胞染色密集区，转至200倍荧光显微镜下进行微血管计数，取平均值作为微血管密度。

2.4 RT-PCR法检测Notch1，Dll4的表达

（1）取大鼠缺血周边区脑组织提取总RNA。（2）逆转录反应：严格按MBI Fermentas公司试剂盒说明进行。（3）PCR扩增。（4）电泳：扩增产物用琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像分析系统对电泳条带进行吸光度（OD值）的半定量分析，结果以目的基因与β-actin OD值的比值表示。

2.5 统计学分析

所有数据经过方差齐性检验和正态性检验，每组样本结果用（x-±s）表示，采用SPSS 19.0统计软件进行单因素方差分析，组间两两比较用q检验，P < 0.05表示差异具有统计学意义。

3　结果

3.1 细胞的扩增培养

原代培养细胞24 h后开始贴壁，3 d时可见贴壁细胞呈典型的成纤维细胞样外观，10 d左右细胞生长达80%～90%融合，呈均一长梭形，传代细胞呈均匀分布，生长迅速，约4～5 d可铺满瓶壁，细胞呈梭形。

3.2 缺血周边区脑组织MVD分析

差异具有统计学意义（P < 0.05，表1），而加用DAPT后BMSCs促血管增生作用受到明显抑制，其差异具有统计学意义（P < 0.01，表1）。

注：a：P＜0.05 vs. MCAO组；b：P<0.01 vs. DAPT组

3.3 脑缺血周边区Notch1，Dll4 mRNA的表达，见表2。

4　讨论

研究表明将BMSCs移植到脑缺血大鼠体内后，脑缺血区新生血管数量明显多于对照组，促进了脑缺血大鼠神经功能的恢复，其机制可能是脑缺血区的血管生长因子VEGF等的表达水平上调［1］。两种细胞均由血管内皮细胞分化而来，受VEGF 与Notch1-Dll4信号通路共同调控。本研究提示，缺血后4 d在脑缺血周边区即可见Notch1和Dll4 mRNA表达升高，7 d达到高峰，之后减弱，BMSCs移植组各个时间点Notch1和Dll4 mRNA的表达明显高于MCAO组，而加用DAPT后各个时间点Notch1 和Dll4 mRNA的表达明显受到抑制，提示BMSCs的确可促进大鼠脑缺血周边区Notch1-Dll4信号通路的表达［2-3］；同时本研究发现缺血后4 d在脑缺血周边区即可见新生微血管，随着天数增加，微血管数量逐渐增多，与Notch1，Dll4 mRNA的表达趋势一致，表明缺血性脑损伤后脑组织新生血管的形成可能与BMSCs移植后促进脑组织中Notch1-Dll4信号通路的表达上调有关。

表2　大鼠脑缺血周边区Notch1、Dll4 mRNA表达情况 （n=5， x- ±s）

参考文献

［1］ 金志贤，王清，毕虹，等.间充质干细胞移植对大鼠肺气肿的疗效及其可能机制［J］.中华医学杂志，2015，95（22）：1731-1735.

［2］ 吕晓霞，黄诚，尹至，等.自体骨髓间充质干细胞移植对膝骨性关节炎的疗效观察［J］.中华细胞与干细胞，2015，5（2）：28-32.

［3］ 孙佳佳，周军，杨惠林.骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤的研究进展［J］.中华创伤，2015，31（6）：568-570.

Effects of Bone Mesenchymal Stem Cells on the Expression of Notch1-Dll4 Signaling Pathway in the Brain of Rats With Focal Cerebral ischemia

LIN Feifei1XIONG Huiling21 The third hospital affiliated to fujian medical university neurology，Fuzhou 350000， China，2 Fujian international travel health care center， Fuzhou 350000，China

【Abstract】

Objective To investigate the effects of BMSCs on the expression of Notch1-Dll4 in the brains of rats with focal cerebral ischemia. Method Sixty male adult Sprague-Dawley rats were randomly divided into 4 groups： Sham group， MCAO group， BMSC group， DAPT group. 24 hours after MCAO，BMSCs were injected into the lateral ventricle of rats in BMSC group， and the same dose of BMSCs contained DAPT was given to the rats in DAPT group. Rats are sacrificed at 4 d， 7 d and 14 d after MCAO. The amount of were counted， and the level of Notch1， Dll4 were detected by RT-PCR. Results The amount of microvessels increased in BMSC group （P＜0.05）. Compared with the MCAO group， the Notch1， Dll4 expression in ischemic brain was upregulated （P＜0.05）. Conclusion BMSCs can improve the by upregulating the expression of Notch1-Dll4 signaling pathway after MCAO in rats.

【Key words】Cerebral ischemia，BMSCs，Notch1

doi：10.3969/j.issn.1674-9316.2015.26.112

【文章编号】1674-9316（2015）26-0154-03

【文献标识码】B

【中图分类号】R683.42