褪黑素对高血压模型大鼠基底前脑和海马细胞及学习记忆的影响

褪黑素对高血压模型大鼠基底前脑和海马细胞及学习记忆的影响

磨洁琳郭灵曾庆堂

(广西医科大学人体解剖学教研室，广西南宁530021)

摘要〔〕目的探讨在褪黑素干预高血压模型大鼠过程中基底前脑三个胆碱能核团神经元、海马星形胶质细胞、学习记忆之间变化的相互关系。方法建立肾性高血压大鼠模型，应用免疫组化方法与Morris水迷宫系统，观察外源性褪黑素干预后，基底前脑内侧隔核(MS)、斜角带核垂直支(vDB)与水平支(hDB)的胆碱乙酰转移酶(ChAT)阳性细胞、海马CA1区的胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)阳性细胞变化及学习记忆变化的趋势及其相互关系。结果肾性高血压大鼠的hDB的ChAT阳性细胞数明显下降，海马CA1区的GFAP阳性细胞数明显升高，学习记忆能力明显下降(P<0.05)；应用褪黑素后可将上述指标的异常变化逆转到接近正常的水平(P<0.05)，但MS或hDB的ChAT阳性细胞数始终均无显著变化(P>0.05)；各组大鼠的ChAT阳性细胞形态或GFAP阳性细胞形态亦均无明显差异。结论在肾性高血压模型大鼠中，褪黑素具有保护基底前脑胆碱能神经元免遭损害的作用，并对海马星形胶质细胞产生抑制效应，褪黑素在早期防治因高血压而诱发的老年血管性痴呆或老年性痴呆可能具有实用价值。

关键词〔〕高血压；褪黑素；基底前脑；胆碱能神经元；海马；星形胶质细胞；学习记忆

中图分类号〔〕R332〔

基金项目：广西青年科学

通讯作者：郭灵(1960-)，男，博士，教授，博士生导师，主要从事发育神经内分泌学研究。

第一作者：磨洁琳(1978-)，女，硕士，讲师，主要从事神经内分泌学研究。

如今已能够人工合成褪黑素，并将其用于治疗高血压及某些脑病获得良好的效果〔1，2〕；外源性褪黑素尚可纠正高血压模型大鼠的神经发生异常与学习记忆障碍〔3〕；在高血压患者的自然增龄过程中，可损伤老年的胆碱能基底前脑与海马，导致老年血管性痴呆或老年性痴呆(AD)的发生〔4，5〕。然而胆碱能基底前脑的神经核团众多、结构复杂，这些核团又与海马密切联系〔6〕。本文观察胆碱能基底前脑的三个核团——内侧隔核(MS)、斜角带核垂直支(vDB)、斜角带核水平支(hDB)的胆碱能神经元表达的标志物胆碱乙酰转移酶(ChAT)、海马CA1区星形胶质细胞表达的标志物胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)、学习记忆三者变化的相互关系。

1材料与方法

1.1材料褪黑素、小鼠抗大鼠胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)单克隆抗体、ABC 试剂盒、粉末型对氨基联苯胺(DAB)、硫酸镍胺均购自Sigma公司；小鼠抗大鼠胆碱乙酰转移酶(ChAT)单克隆抗体，购自Chemicon公司； DMS-2型Morris水迷宫购自中国医学科学院药物研究所；HM500高级双制冷切片机购自德国Leica公司；C2目镜微测尺购自上海光学仪器厂。

1.2方法

1.2.1实验动物及分组选取清洁级Wistar雄性大鼠40只(体重140～170 g)，由广西医科大学医学实验动物中心提供。饲养环境温度25℃～28℃，光暗周期12 h。随机分为四组：正常组、假手术组、高血压组、褪黑素组，每组10只，假手术组的大鼠手术除不给两侧肾动脉安置银夹外，其余手术步骤均与高血压组的相一致；未给正常组大鼠做任何处理，但在相同条件下饲养。

1.2.2建立动物模型与药物干预参考黄如训等〔7〕双肾双夹法，在大鼠两侧肾动脉安置银夹从而制成肾性高血压模型，对处于清醒状态下的大鼠用套尾法测量其尾动脉收缩压，将术后第4周血压>150 mmHg的大鼠确定为建立肾性高血压模型成功的大鼠〔7〕，最后将术后6w血压仍然超过上述标准的大鼠随机抽样分入高血压组或褪黑素组，并进行相应干预。褪黑素组，每日上午10时，按剂量(20 μg/kg体重)腹腔注射褪黑素(将褪黑素溶解于5%乙醇生理盐水中)；假手术组，腹腔注射等体积的5%乙醇生理盐水，这两组大鼠均在相同时间和地点连续腹腔注射14 d，正常组和高血压组不进行任何干预。

1.2.3Morris水迷宫测试在完成相应的干预后，对每组大鼠进行定位航行测试和空间探索试验，分别记录大鼠在120 s内找到平台的逃避潜伏期时间和记录大鼠在120 s内游泳穿越过原来所放下平台位置的次数(跨平台次数)，前一项指标反映出被测试大鼠的学习能力：逃避潜伏期越长，学习能力越弱，反之亦然；后一项指标反映出被测试大鼠的空间记忆能力：跨平台次数越多，空间记忆能力越強，反之亦然。

1.2.4固定与组织切片完成行为测试后，1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠，开胸经左心室插管至升主动脉用4%多聚甲醛(0.1 mol/L PBS配制，pH7.4)灌注固定大鼠。固定完毕首先除掉大鼠颅盖骨，继之用耳杆分别插入两侧外耳道底，将大鼠头部正确安置在脑立体定位仪上，最后参照大鼠脑立体定位图谱〔8〕，暴露并切取出含有基底前脑和海马组织块，冠状连续冰冻切片，隔三取一，片厚40 μm，待染色反应。

1.2.5免疫组织化学反应染色应用ABC法对基底前脑的MS、vDB与hDB的切片进行ChAT(1∶800)免疫组织化学反应染色；对海马的切片进行GFAP(1∶800)免疫组织化学染色反应，DAB加入硫酸镍胺显色(阳性反应颜色为紫蓝色)；常规脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。阴性对照反应除用PBS液体代替笫一抗体外，其余步骤与上述相同(反应结果为无颜色)。

1.2.6细胞观察和计数在10×40倍的光镜下，观察细胞形态变化并进行细胞计数。ChAT阳性细胞计数：每只大鼠选择基底前脑的MS、vDB、hDB典型切面(前囟前0.4 mm、0.2 mm、 0.0 mm)各3张切片〔8〕。三个核团在光镜下的境界划分方法是：经两侧前连合上缘及视神经背侧的脑腹侧沟顶端各作一条横线，在上横线上方的区域为MS，在上、下两横线之间的区域为vDB，在下横线下方的区域为hDB。计数时，凡压在上、下横线的细胞分别计入MS和vDB内。分别计数右侧MS、vDB和hDB内所有阳性细胞数，并观察细胞形态变化。每只大鼠选取右侧海马CA1区(前囟后3.2 mm、3.4 mm、3.6 mm)切片各3张〔8〕，对每张切片的相应部位随机选取3个视野，计数所有阳性细胞，并观察细胞形态变化。

1.3统计学方法采用SPSS10.0统计软件进行单因素方差分析及Games-Howell检验。

2结果

2.1Morris水迷宫行为测定结果在四组大鼠中，高血压组大鼠的逃避潜伏期最长(P<0.05)，而跨平台次数则变得最少(P<0.05)；褪黑素组大鼠的逃避潜伏期与跨平台次数分别比高血压组大鼠的眀显缩短或眀显增多(P<0.05)，并接近于假手术组或正常组大鼠的水平(P>0.05)。见表1。

表1　四组大鼠水迷宫测试指标比较 ± s， n=10)

与假手术组或正常组比较：1)P<0.05；与高血压组比较：2)P<0.05，下表同

图1　四组大鼠斜角带水平支(hDB) 的 ChAT阳性细胞的变化(DAB,×400)

图2　四组大鼠海马CA1区的GFAP阳性细胞的 变化(DAB，×400)

2.2各脑组织ChAT、GFAP阳性细胞表达比较图1，图2可见，基底前脑ChAT免疫反应产物被染成紫蓝色，主要位于神经元胞质及近侧突起内，而胞核未着色。四组大鼠的MS、vDB与hDB的ChAT阳性细胞的形态与大小均无明显差异。海马CA1区的GFAP阳性细胞形态似蜘蛛状，胞体和突起呈紫蓝色；四组大鼠的GFAP阳性细胞形态与大小也均无明显变化。在四组大鼠中，高血压组大鼠hDB的ChAT 阳性细胞数最少(P<0.05)，而海马CA1区的GFAP阳性细胞数则最多(P<0.05)；褪黑素组大鼠hDB的ChAT 阳性细胞数较高血压组大鼠hDB的眀显升高(P<0.05)，但褪黑素组大鼠海马CA1区的GFAP阳性细胞数却比高血压组大鼠的眀显降低(P<0.05)，并接近于假手术组大鼠或正常组大鼠的水平(P>0.05)。然而，四个组大鼠的MS或vDB的ChAT 阳性细胞数之间均不存在显著性差异(P>0.05) 。见表2。

表2　各组大鼠脑组织ChAT及GFAP阳性

3讨论

研究证实，高血压在其发生与发展过程中，随着患者年龄增大而可累及胆碱能基底前脑与海马等结构，引发老年血管性痴呆或老年性痴呆〔4，5〕，使患者最终丧失最基本的生活自理能力，给家庭及社会带来严重的负担，故早期诊治这类致残的终极性疾病格外重要。然而，目前在高血压的消长中，有关胆碱能基底前脑的具体核团受到损害及其与海马的相互关系不够明确，不利于临床神经科学的准确形态定位诊断；而且也没有应用外源性褪黑素干预由高血压可能影响上述结构与功能变化的尝试，这对筛选出具有防治老年血管性痴呆或老年性痴呆潜力的药物进行针对性早期干预也不便利。本文用褪黑素治疗高血压大鼠2 w后，CHAT和GFAP阳性细胞接近正常水平，与其他学者的结果相似〔9〕，也与本研究组已报道的结果相一致〔3〕，说明高血压在进展到一定时间段后，可对胆碱能基底前脑、海马及学习记忆功能产生负性影响，应用褪黑素可以改善这些异常变化。

在本研究的结果中，胆碱能基底前脑的三个核团的ChAT阳性细胞数变化并不一致：这为在建立肾性高血压6 w后胆碱能核团及其神经元受损做出了定位——在此阶段hDB的ChAT阳性神经元数已受到不良影响，同时也提示基底前脑胆碱能神经元核团之间在由高血压引起损伤的易感性方面可能存在着结构性或部位性的差异。此外，本研究的结果还显示，在患高血压时海马CA1星形胶质细胞数明显增多，这可能与该区域的星形胶质细胞针对异常升高的血压做出应答性增生反应有关；相比之下，本研究各组大鼠ChAT阳性细胞形态或GFAP阳性细胞形态均无明显差异，这可能与高血压未损害到细胞骨架内部的构筑有关，但以上推测均仍需要进一步研究加以证实。

本研究结果还显示，应用外源性褪黑素2 w后，对hDB与海马CA1细胞所产生的效应也是不同的：对hDB的ChAT阳性神经元具有正性促进作用，这可能与褪黑素抗氧化应激、抗细胞凋亡、高调ChAT基因表达蛋白产物有关〔10〕；而对海马CA1的GFAP阳性细胞具有抑制作用，这可能与褪黑素低调GFAP基因表达蛋白产物或阻止星形胶质细胞增殖有关，由此便可减少在脑实质内胶质瘢痕的形成，不随意侵占属于神经元的固有领地，对于确保神经元能在既定大小的天然环境里发挥正常学习记忆功能具有重要的生物学意义。有关隐藏在褪黑素对胆碱能神经元与星形胶质细胞具有不同作用模式背后的机制可能值得深入研究，或许可从中得到某些个体化防治老年血管性痴呆或老年性痴呆的启发。

总之，本研究初步证实了褪黑素可以阻止由肾性高血压引起的hDB胆碱能神经元数减少，降低海马CA1区星形胶质细胞数增多，从而提高学习记忆能力；提示褪黑素有可能在防治老年血管性痴呆或老年性痴呆方面成为一个有前景的药物。

4参考文献

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〔2013-07-25修回〕

(编辑安冉冉/曹梦园)