溃疡性结肠炎大鼠血清白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-4动态表达规律

溃疡性结肠炎大鼠血清白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-4动态表达规律

朱向东曹燕飞王燕汪斌段永强

(甘肃中医学院，甘肃兰州730000)

摘要〔〕目的探讨溃疡性结肠炎(UC)大鼠血清白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-4的动态表达规律。方法将60只大鼠随机分为空白组10只、乙醇组10只，模型组40只(3、7、14、21 d各10只)，采用TNBS/乙醇灌肠法制备溃疡性结肠炎大鼠模型，于制模后3、7、14、21 d 4个时间点采用ELISA法检测大鼠血清IL-1β、 TNF-α、IL-4水平，光镜观察结肠组织形态并评分。结果制模后3 d大鼠结肠出现炎症和溃疡，且随着时间推移而加重，7～14 d溃疡和炎症最为严重，21 d溃疡和炎症已经有所修复。模型组各时间点大鼠血清促炎因子IL-1β、TNF-α均高于空白组和乙醇组，抗炎因子IL-4水平均低于空白组和乙醇组，以7 d和14 d升高或降低更为显著(P<0.05、P<0.01)； 7、14 d组与3d组比较，IL-1β、 TNF-α水平进一步升高(P<0.01)，而IL-4水平进一步降低(P<0.01)；21 d组与7、14 d组比较，IL-1β、 TNF-α水平下降，而IL-4水平则升高(P<0.05)。结论促炎因子IL-1β、 TNF-α和抗炎因子IL-4在UC发病中起重要作用，UC的发病及严重程度与促炎因子IL-1β、TNF-α、IL-4的动态表达及失衡密切相关。

关键词〔〕溃疡性结肠炎(UC)；白细胞介素-1β；肿瘤坏死因子-α；白细胞介素-4

中图分类号〔〕R574.62〔

基金项目：国家自然科学基金(No.81060283)

通讯作者：王燕(1979-)，女，硕士，讲师，主要从事中医药防治溃疡性结肠炎的应用基础研究。

第一作者：朱向东(1973-)，男，副教授，硕士生导师，主要从事中医药防治溃疡性结肠炎的应用基础研究。

溃疡性结肠炎(UC)是以腹痛腹泻、 黏液脓血便持续或反复发作为主要症状，具有癌变倾向，属于难治性消化系统疾病，目前尚缺乏满意的治疗方法。该病发病原因及机制尚不明确。目前促炎细胞因子及抑炎细胞因子失衡机制越来越受到人们的重视〔1〕。体外研究表明促炎性细胞因子白细胞介素(IL)-1β、肿瘤坏死因子(TNF)-α和抗炎细胞因子IL-4等可以通过多种病理学作用参与肠黏膜炎性反应的发生和发展过程〔2〕。本研究通过动态测定UC模型大鼠血清炎性反应细胞因子水平，探讨其在UC发病机制中的作用。

1资料与方法

1.1动物采用SPF级Wistar大鼠30只，体质量160～200 g，雌雄各半，由甘肃中医学院科研实验动物中心提供，SPF级动物质量合格证号：SCXKC(甘)2004-0006；SPF级实验设施合格证号：SYXKC(甘)2004-0006-0001561。

1.2试剂蛋白标准液、考马斯亮蓝溶液(20090825)均购自南京建成生物工程公司；2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)：购于北京邦定泰克生物技术有限公司，由美国Sigma公司生产，批号为(2008-16-2)；大鼠IL-β、TNF-α、IL-4检测试剂盒购自深圳市达科为生物技术有限公司。

1.3仪器与设备Biorad iMark酶标仪(美国BLO-RAD公司)；CT14RD高速冷冻离心机(天美科技有限公司)；303-2型恒温培养箱(北京科伟永鑫实验设备仪器公司) 。

1.4方法

1.4.1造模方法采用TNBS/乙醇溶液灌肠法制作UC大鼠模型：将大鼠禁食(不禁水)24 h，用10%水合氯醛腹腔麻醉(0.3 ml/100 g)后，一次性将TNBS/乙醇液(100 mg/kg TNBS+50%的乙醇0.25 ml)溶液用橡胶输液管轻缓注入大鼠距肛门约7～8 cm深的肠腔内，留置数分钟，让动物保持平躺状态，自然清醒。

1.4.2分组与给药、取材将实验动物分为6组：空白组、乙醇组、模型组(3、7、14、21 d)，每组10只。空白组不处理，模型组均以100 mg/kg TNBS加50%乙醇0.25 ml混合试剂灌肠，乙醇组50%乙醇0.25 ml灌肠。分别于制模后3、7、14、21 d分批处死大鼠并取材，乙醚麻醉后于股动脉采血，室温静置10～20 min，3 000 r/min离心10 min，收集上清，检测指标。脱颈处死大鼠，剖取病变最严重处结肠5～8 cm，用冷 PBS清洗结肠，肉眼观察结肠损伤情况并评分。

1.4.3结肠大体形态损伤评分大体形态损伤参照Luketal标准 0分：无损伤；1分：充血但没有溃疡；2分：充血而且肠壁变厚但没有溃疡；3分：有一处小溃疡，直径约0～1 cm；4分：溃疡较大，直径约1～2 cm，但肠管与外周脏器无粘连；5分：溃疡直径1～2 cm，肠管增厚，与周围脏器粘连严重。

1.4.4指标检测采用ELISA法测定IL-1β、TNF-α，IL-4严格按试剂盒要求操作。在检测波长450 nm和校正波长620 nm同时读板，通过标准曲线，计算各样本含量。

1.5统计学方法应用SPSS17.0软件进行t检验。

2结果

2.1一般状况各组大鼠造模后第1天均出现懒动，扎堆，食量下降，稀便且部分大鼠出现血便；第3天体重开始下降；第7天体重下降明显，毛色无光泽，食量低于正常，仍有稀便；第14天大鼠活动正常，仍有稀便；第21天造模各大鼠毛色晦暗，饮食趋于正常，时有稀便。乙醇组造模后第1天出现稀便，于第2天症状缓解，第3天体重出现增长，7 d后完全恢复正常。

2.2结肠组织大体形态及评分空白组和乙醇组大鼠肠道不增厚，无粘连，肠皱襞纹理清晰，肠黏膜光滑，未见明显的充血水肿、糜烂及溃疡。各造模组与乙醇组(0.13±0.35)和空白组(0.10±0.11)相比较，均有显著差异(P<0.01)。3 d组(1.33±0.98)大鼠肠壁可见明显充血水肿，肠壁增厚，溃疡形成；7 d组(2.62±0.87)可见肠道粘连，结肠缩短，黏膜坏死，呈黑褐色，亦有大鼠可见肠胀气；14 d组(2.17±0.83)溃疡开始愈合，大鼠肠道仍然有粘连，偶有肠胀气出现；21 d组(1.85±0.68)溃疡面积较7 d组变小，可见愈合后的瘢痕，各大鼠肠壁仍有增厚变硬及肠道粘连，与7 d组比较差异显著(P<0.05)。

2.3UC大鼠血清IL-β的动态表达与空白组和乙醇组比较，各模型组大鼠血清IL-β显著增高，其中以7 d组升高最为明显(P<0.01)；与3 d组比较，7 d组IL-β水平升高达到最高值；与7 d或14 d比较，21 d组IL-β水平又明显下降(P<0.05)。见表1。

2.4UC大鼠血清TNF-α的动态表达与空白组和乙醇组比较，各模型组大鼠血清TNF-α含量明显升高(P<0.01，P<0.05)，其中尤其以14 d组升高更为显著(P<0.01)。与7 d或14 d比较，21 d组TNF-α含量又明显下降(P<0.05)。见表1。

2.5UC大鼠血清IL-4的动态表达与空白组和乙醇组比较，各模型组大鼠血清IL-4含量明显下降(P<0.01，P<0.05)，其中尤其以14 d组下降更为显著(P<0.01)。与7 d或14 d比较，21 d组IL-4含量又明显升高(P<0.05)。见表1。

表1　UC大鼠血清IL-1β、TNF-α、IL-4

与空白组和乙醇组比较：1)P<0.05，2)P<0.01；与3 d组比较：3)P<0.01；与7 d或14 d比较：4)P<0.05

3讨论

肠黏膜持续的炎症损伤和免疫异常被认为是UC发病的基本机制〔2〕。细胞因子失衡是UC产生肠道非特异性炎性反应的关键环节〔3〕。参与炎症反应的细胞因子分为促炎和抗炎两类。TNF-α在UC发病中被公认为是一种促炎细胞因子，它可以促使肠上皮内淋巴细胞增殖、移行和分化，在这一过程中会释放大量的非特异性或特异性炎性分子，在肠黏膜局部起到免疫破坏作用，反映到UC则是肠黏膜局限性溃疡、炎细胞的出现和延续。活动期UC患者血清TNF-α水平明显增高,提示TNF-α参与了UC的病理过程〔4〕。TNF-α主要由激活的单核细胞和巨噬细胞产生，其促炎机制主要是参与激活中性粒细胞和上调黏附分子、促进肉芽肿的形成。TNF-α还能够加强单核巨噬细胞的吞噬功能，刺激IL-8、IL-1等其他细胞因子合成释放，产生细胞因子的瀑布效应，促进炎症反应的扩大〔5〕。本实验证实了TNF-α的动态表达与UC的发病和加重呈正相关。

IL-1β是诱导炎症性肠病(IBD)肠道炎症的一种非常重要的细胞因子，它能使CD4+T细胞活化，促进B细胞生长、活化以及IL-2R表达，引起炎症介质释放〔6〕。IL-1受体拮抗剂IL-1Ra可以通过竞争结合靶细胞上的IL-1受体，阻断IL-1的促炎效应。但UC患者IL-1Ra和IL-1β严重失衡，肠上皮细胞只分泌的IL-1Ra，不足以中和由固有膜单核细胞分泌的IL-1β等炎性细胞因子〔7〕，所以，在UC患者会因为肠黏膜IL-1β的大量分泌促使炎症持续和加重。IL-1β有多种生物学效应，IL-1β能够使免疫上调和促进炎症活性，能通过自分泌或旁分泌促进其下游细胞因子(如TNF-α)的表达和产生，并和其共同作用，引起一系列肠黏膜损伤和肠道炎症反应。IL-1β还通过促进白细胞黏附分子的表达，趋化中性粒细胞等炎性细胞进入肠道病变部位，引发一系列肠组织破坏和肠道炎症反应〔8〕。

有研究表明〔9〕，UC患者肠黏膜IL-4能抑制杀伤细胞的活性，并抑制肠黏膜固有层单核细胞的增殖，缓解其细胞毒性。体外实验已经证明〔10〕，IL-4能抑制炎症介质IL-1β、TNF-α的释放，从而抑制IL-1、TNF-α的促炎作用。

本实验说明IL-1β、TNF-α、IL-4的表达与结肠病理损伤有着高度一致性，IL-1β、TNF-α、IL-4的动态表达与UC 的发生和严重程度呈正相关。本实验也证实UC的发病机制之一是抗炎因子与抑炎因子的平衡遭到了破坏，所以从纠正肠道异常免疫反应角度研制治疗UC的新药应该是非常重要的思路。

4参考文献

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8Hue S,Ahern P,Buonocore S,etal.Interleukin-23 drives innate and T cell mediated intestinal inflammation〔J〕.J Exp Med，2006；203：2473-83.

9Kullberg MC，Jankovic D，Feng CG,etal.IL-23 plays akey role in Helicobacter hepaticus-induced T cell dependent colitis〔J〕.J Exp Med，2006；203：2485-94.

10Ashwood P,Harvey R，Verjee T,etal.Functional inter-actions between mucosal IL-1，IL-1Ra and TGF-β in ulcerative colitis〔J〕.Inflamm Res，2004；53：53-9.

〔2013-06-17修回〕

(编辑赵慧玲/曹梦园)