慢性阻塞性肺疾病患者肺组织中核转录因子-κB、转化生长因子-β1表达与气道重塑的关系

慢性阻塞性肺疾病患者肺组织中核转录因子-κB、转化生长因子-β1表达与气道重塑的关系

管频1于化鹏2李伟1吴智勇1吴洁3陈世良1

(南方医科大学研究生物学院，广东广州510000)

摘要〔〕目的观察COPD患者肺组织中核转录因子(NF)-κB、转化生长因子(TGF)-β1的表达及与气道重塑的相关性。方法标本取自40例因肺部孤立性结节行肺叶切除术患者的肺组织，按术前肺功能分为非COPD组(A 组，20例) 及COPD组(B组，20例)。所取肺组织HE染色后光镜下观察肺组织的病理形态学改变,以半定量图像分析法测量小气道管壁和平滑肌层厚度。用Western印迹法检测肺组织中NF-κB、TGF-β1的表达。结果①B组NF-κB、TGF-β1表达均高于A组(均P<0.05)，且NF-κB与TGF-β1表达存在正相关(P<0.05)；②肺组织中NF-κB、TGF-β1的表达与单位长度的管壁面积(WAt/Pi,μm2/μm)及单位长度的平滑肌层面积(WAsm/Pi,μm2/μm) 表达均呈正相关(P<0.05)。③FEV1/ FVC、FEV1%预计值分别与NF-κB、TGF-β1的表达呈负相关(P<0.05)。结论COPD肺组织中NF-κB、TGF-β1的表达增加，细胞因子的表达增加使其发挥的生物学效应增强，从而促进气道重塑，进一步影响肺功能。

关键词〔〕慢性阻塞性肺疾病(COPD)；气道重塑；转化生长因子-β1；核转录因子-κB

中图分类号〔〕R56〔

基金项目：海南省自然科学基金(807081)

通讯作者：于化鹏(1960-)，男，博士生导师，教授，主要从事支气管哮喘发病机制研究。

1海南省人民医院医疗保健四区

2南方医科大学附属珠江医院呼吸内科3海南医学院

第一作者：管频(1980-)，女，主治医师，硕士，主要从事慢性阻塞性肺疾病气道重塑研究。

气道重塑是慢性阻塞性肺疾病(COPD)气流受限的主要病理基础,是COPD病变呈持续发展的关键因素〔1，2〕。 在众多炎症因子及细胞外基质调节因子中，转化生长因子(TGF)-β1是同时具有重要的免疫调节和致纤维化活性，故而在气道炎症及气道重塑中占重要地位〔3〕。核转录因子(NF)-κB是在肺组织氧化应激、细胞凋亡中活化的主要转录因子，它能够引起许多致炎症基因的表达上调，从而影响了气道炎症及气道重塑〔4〕。本文探讨TGF-β1、 NF-κB的表达与气道重塑指标的相关性。

1材料与方法

1.1资料选取2009年3～7月因发现肺部孤立性结节于我院胸外科住院拟行行肺叶切除术的40例患者，入选患者近6 w内无急性加重。按术前1 w的肺功能结果分为非COPD组(A组，20例)及与COPD组(B组，20例)。COPD的诊断符合COPD诊治指南〔1〕。两组患者的年龄、性别等无明显差异。患者均除外先天性心脏病、左心疾病、COPD以外的其他肺疾病以及全身其他系统慢性病变。实验所需的肺组织取远离肺癌病灶5 cm以上、无肿瘤浸润的外周肺组织。两组受试者性别、年龄之间无明显差异(P>0.05)。见表1。

1.2标本采集及HE染色处理手术取下肺组织标本,迅速用10%福尔马林充分浸泡固定12 h,常规梯度酒精脱水,石蜡包埋。取上述人肺组织石蜡块,切片(5 μm) ,HE染色后,光镜下观察其病理形态学改变。

表1　两组受试者一般资料及肺功能比较

1.3支气管形态学测量方法随机选取HE切片中内周长<1 000 μm,长径/短径≤2,较规整的小支气管,每个标本选3～6个支气管横截面积,采用META MORPH 图像分析系统(美国Universal Imaging Corporation) 进行测量和计算，以单位长度的管壁面积表示管壁厚度,同样以单位长度的平滑肌层面积表示平滑肌层厚度〔5〕。

1.4Western印迹检测外周气道肺组织TGF-β1、NF-κB蛋白质表达采用Western印迹法检测外周气道肺组织的NF-κB p65(分子量65 kD)、TGF-β1(分子量12.5 kD)的表达，以GAPDH为内参蛋白(分子量36 kD)。应用RIPA蛋白裂解液从肺组织中提取蛋白质,考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度后于-80 ℃保存。取核蛋白样品加等体积的2×电泳样品缓冲液加热变性后,以20 μg蛋白/泳道上样,经10% SDS-PAGE电泳后,电转移至硝酸纤维膜。予丽春红S染色确定转膜情况并标记蛋白质标准参照物位置。用5%脱脂奶粉封闭后,先后加入一抗(NF-κB p65抗体或TGF-β1抗体)及辣根过氧化物酶标记的二抗,DAB显色剂显色,结果:阳性区域显深棕色。拍摄滤膜照片,并通过凝胶成像系统定量扫描灰度值，NF-κB p65/GAPDH吸光度比值来表示。

1.5统计学方法采用SPSS13.0软件进行t及χ2检验。

2结果

2.1两组肺组织TGF-β1、NF-κB表达比较TGF-β1和NF-κB表达在B 组均明显高于A组(P<0.05)。见表2，图1。

2.2两组支气管形态学测量结果比较管壁厚度、平滑肌厚度在B组均明显高于A组(P<0.05)。见表2。

2.3相关分析COPD患者外周肺组织TGF-β1表达与NF-κB的表达正相关(r=0.783,P=0.000)。NF-κB的表达与管壁厚度、平滑肌厚度以及肺功能指标FEV1/ FVC、FEV1%预计值均正相关(r值分别为：0.882、0.629、0.797、0.738，P值均0.000),TGF-β1与管壁厚度、平滑肌厚度以及肺功能指标FEV1/ FVC、FEV1%预计值均正相关(r值分别为：0.752、0.694、0.968、0.706,P值均0.000)。

图1　Western印迹法检测两组肺组织NF-κB、TGF-β1表达

组别TGF-β1NF-κB管壁厚度(μm2/μm)平滑肌厚度(μm2/μm)A组2.93±0.738.68±3.6758.16±9.836.75±1.79B组5.07±0.6022.69±7.8381.46±8.3814.87±4.11t/P值10.156/0.0007.244/0.0008.065/0.0008.102/0.000

3讨论

COPD是肺组织对于有害颗粒或气体产生的异常炎性免疫反应相关的复杂综合征，大量的实质、炎症细胞和细胞因子参与了COPD的发生和发展过程〔6〕。在气道炎症和气道重塑中，TGF-β1在细胞外基质活化后，通过smad依赖或非依赖信号转导途径，TGF-β1调节不同类型细胞的功能，例如Tp、Th17，特别是Treg(调节性T细胞)及成纤维细胞来促进炎症反应、合成细胞外基质蛋白及促进胶原沉积等〔3〕，从而引起气道修复、重塑，也就是说，TGF-β1是气道重塑的阀门，是这个过程的关键。已有研究发现， COPD患者气道上皮及肺泡巨噬细胞中TGF-β1表达增加，且随吸烟量增多而升高〔7，8〕；且COPD患者TGF-β1的表达水平与小气道阻塞程度有关，在外周气道的狭窄、纤维化中起到重要作用〔9，10〕。而本实验发现，COPD患者外周肺组织中TGF-β1表达均明显高于非COPD者,并与管壁厚度、平滑肌厚度及肺功能呈正相关，这与以前关于TGF-β1在COPD患者气道重塑中的重要作用的研究是一致的。

NF-κB参与许多炎性因子的基因调控，例如白细胞介素(IL)-1、IL-6、IL-8、MCP-1、TNF-α,ET-1、ICAM-1及生长因子等〔11〕。在TGF的上游启动子上也存在着NF-κB反应元件〔12〕，有研究发现中性粒细胞弹性蛋白酶通过NF-κB途径诱导了人气道平滑肌TGF-β1的表达〔13〕。另一方面，也有研究发现TGF-1的活化因子组织转谷氨酰胺酶(tTG)基因的启动子中含有NF-κB的结合位点，因而NF-κB能从多方面上调TGF-β1的表达〔14〕。本实验发现，COPD病程中,NF-κB可能启动了TGF-β1基因的转录,上调了TGF-β1的表达，进一步发挥生长因子的多方面效应，促进气道重塑而影响肺功能。

4参考文献

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〔2013-08-20修回〕

(编辑赵慧玲/曹梦园)