荧光光谱法研究苏丹Ⅳ与鲱鱼精DNA的相互作用

付银环，付彩霞

（1.无棣第一中学生物学科，山东无棣251900；2.滨州医学院化学教研室，山东烟台264003）

苏丹属于含苯类偶氮染色剂，具有潜在的致癌性［1－4］，我国禁止其作为食品添加剂。作者在pH 值为7.4的Tris－HCl缓冲溶液中，利用荧光光谱法研究苏丹Ⅳ与鲱鱼精DNA 之间的作用模式和作用机制，测定了结合常数、结合位点数及热力学参数，拟为从分子水平研究苏丹Ⅳ与鲱鱼精DNA 的相互作用提供帮助。

1 实验

1.1 试剂与仪器

鲱鱼精DNA，北京拜尔迪生物技术有限公司；苏丹Ⅳ、Tris，中国医药集团上海化学试剂有限公司；1.6×10－3mol·L－1鲱鱼精DNA 储备液（用Tris－HCl缓冲溶液配制）；1.0×10－3mol·L－1苏丹Ⅳ储备液（用无水乙醇配制）；0.05 mol·L－1pH 值7.4 的Tris－HCl缓冲溶液（含0.1 mol·L－1NaCl）；0.01 mol·L－1KI溶液。

LS－45／55型荧光／磷光／发光分光光度计，美国Perkin Elmer公司；PHS－3C型酸度计，上海雷磁仪器厂；电热恒温水浴锅，龙口市先科仪器有限公司；KQ－500B型超声波清洗器，昆山超声仪器有限公司；BP211D 型电子分析天平，上海精密仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 荧光光谱

移取2.00 mL 苏丹Ⅳ溶液于1cm 石英比色皿中，依次加入不同量的鲱鱼精DNA，摇匀，分别在22 ℃、37 ℃下静置5 min，扫描荧光光谱。Δλex＝5 nm、Δλem＝5nm，激发波长为650nm，荧光扫描范围为630～670nm。

1.2.2 单、双链DNA 作用的比较实验

单链DNA（ssDNA）的制备：将双链DNA（dsDNA）加至10mL比色管中，置于沸水浴中加热30min后，迅速放到冰水浴中冷却，即得到ssDNA。

于两组5mL比色管中依次加入2.00mL苏丹Ⅳ溶液，分别加入不同量的ssDNA 溶液和dsDNA 溶液。摇匀，在22 ℃下静置5min，扫描荧光光谱，记录650nm 处的荧光强度。

1.2.3 KI荧光猝灭实验

在1cm 比色皿中加入2.00 mL 苏丹Ⅳ溶液，再加入100μL鲱鱼精DNA，摇匀，再加入不同量的KI溶液，摇匀，在22 ℃下静置5min，记录650nm 处的荧光强度。

2 结果与讨论

2.1 鲱鱼精DNA对苏丹Ⅳ荧光光谱的影响

苏丹Ⅳ具有较大的平面芳香环，在Tris－HCl缓冲溶液中受到激发能发射荧光。图1是295K时鲱鱼精DNA 对苏丹Ⅳ荧光光谱的影响。

图1 295K 时鲱鱼精DNA对苏丹Ⅳ荧光光谱的影响Fig.1 Effect of herring sperm DNA on fluorescence spectra of Sudan Ⅳat 295K

由图1可知，苏丹Ⅳ的最大发射波长为650nm；随着鲱鱼精DNA 浓度的增大，苏丹Ⅳ的荧光强度不断减弱，表明苏丹Ⅳ与鲱鱼精DNA 之间发生了相互作用［5－6］，鲱鱼精DNA 能猝灭苏丹Ⅳ的内源性荧光。

2.2 鲱鱼精DNA 对苏丹Ⅳ的荧光猝灭机制

荧光猝灭作用因猝灭机制不同可分为动态猝灭、静态猝灭，可用Stern－Volmer方程［7－8］表示：

式中：F0和F分别为猝灭剂不存在和存在时的荧光强度；cDNA为猝灭剂浓度；KSV为猝灭常数；τ0为无猝灭剂时荧光分子的平均荧光寿命（10－8s）；Kq为双分子猝灭过程的速率常数。以F0／F对cDNA作不同温度下的Stern－Volmer曲线（图2），斜率即为KSV。

按式（1）及图2计算295K、310K 下苏丹Ⅳ与鲱鱼精DNA 相互作用的荧光猝灭常数和相关系数，结果见表1。

由表1可知，Kq远远大于最大扩散碰撞速率常数2.0×1010L· mol－1·s－1，且Kq随着温度的升高而减小。表明，鲱鱼精DNA 对苏丹Ⅳ的猝灭机制是静态猝灭。

图2 295K 和310K 下鲱鱼精DNA对苏丹Ⅳ荧光猝灭的Stern－Volmer曲线Fig.2 Stern－Volmer curves for the fluorescence quenching of Sudan Ⅳby heering sperm DNA at 295K，310K

表1 295K 和310K 下苏丹Ⅳ与鲱鱼精DNA相互作用的荧光猝灭常数和相关系数Tab. 1 Fluorescence quenching constants and the correlation coefficients for interaction between Sudan Ⅳand heering sperm DNA at 295K，310K

2.3 苏丹Ⅳ与鲱鱼精DNA相互作用的结合常数和结合位点数的确定

苏丹Ⅳ与鲱鱼精DNA 之间相互作用的结合常数（KA）和结合位点数（n）可由式（2）［9］计算：

以lg［（F0－F）／F］对lgcDNA作图，通过斜率和截距求出苏丹Ⅳ与鲱鱼精DNA 相互作用的结合常数和结合位点数，结果见表2。

表2 苏丹Ⅳ与鲱鱼精DNA相互作用的相关参数Tab.2 Related parameters for the interaction between Sudan Ⅳand herring sperm DNA

由表2可知，苏丹Ⅳ与鲱鱼精DNA 的结合常数KA数值较大，故苏丹Ⅳ与鲱鱼精DNA 间存在较强的相互作用，且随温度的升高结合能力下降。

2.4 苏丹Ⅳ与鲱鱼精DNA 的相互作用力类型

药物小分子和生物大分子之间的作用力主要有氢键、静电作用力、范德华力、疏水作用力［10－11］。根据热力学公式（3）、（4）、（5）计算不同温度下的结合常数及ΔH、ΔS、ΔG，结果见表2。

根据反应前后热力学焓变ΔH和熵变ΔS的相对大小，可以判断药物小分子与生物大分子之间的主要作用力类型［12］：ΔH＞0、ΔS＞0，主要为疏水作用力；ΔH＜0、ΔS＜0，主要为氢键和范德华力；ΔH＜0、ΔS＞0，主要为静电作用力。

由表2可以看出，苏丹Ⅳ与鲱鱼精DNA 的相互作用是自发的（ΔG＜0）；主要作用力是氢键和范德华力（ΔH＜0、ΔS＜0）。

2.5 单、双链DNA作用的比较实验

研究表明，小分子与DNA 作用主要存在3 种结合模式：嵌插结合、沟槽结合、静电作用［13－14］。本实验通过研究ssDNA 和dsDNA 对苏丹Ⅳ的荧光猝灭作用来研究苏丹Ⅳ与鲱鱼精DNA 相互作用的结合模式。如果苏丹Ⅳ与鲱鱼精DNA 相互作用通过嵌插结合，则ssDNA 对苏丹Ⅳ猝灭常数比dsDNA 对苏丹Ⅳ猝灭常数小，嵌插结合时dsDNA 的结构会被破坏，而ssDNA 的结构则不会被破坏；如果通过沟槽结合，则ssDNA 对苏丹Ⅳ猝灭常数比dsDNA 对苏丹Ⅳ猝灭常数大；如果通过静电作用，则ssDNA 对苏丹Ⅳ猝灭常数和dsDNA 对苏丹Ⅳ猝灭常数相同。

图3是单、双链DNA 对苏丹Ⅳ的荧光猝灭Stern－Volmer曲线。

图3 单、双链DNA对苏丹Ⅳ的荧光猝灭的Stern－Volmer曲线Fig.3 Stern－Volmer curves for fluorescence quenching of Sudan Ⅳby ssDNA and dsDNA

由图3可知，ssDNA 和dsDNA 均能猝灭苏丹Ⅳ的荧光，但是ssDNA 对苏丹Ⅳ的猝灭程度更强，说明苏丹Ⅳ与鲱鱼精DNA 的结合模式是沟槽结合。

2.6 KI荧光猝灭实验

KI作为一种强猝灭剂，也可用来研究苏丹Ⅳ与鲱鱼精DNA 相互作用的结合模式。当小分子与DNA以嵌插结合模式发生作用时，小分子嵌插到DNA 螺旋双链的碱基之间，DNA 可以保护小分子，防止小分子的荧光被KI猝灭。然而当小分子与DNA 以沟槽结合模式发生作用时，小分子会部分受到DNA 的保护，KI只能在一定程度上猝灭小分子的荧光。

图4是KI对苏丹Ⅳ荧光强度的影响。

图4 KI对苏丹Ⅳ荧光强度的影响Fig.4 Effect of KI on fluorescence intensity of Sudan Ⅳ

由图4可看出，加入鲱鱼精DNA 后，KI的猝灭常数变大了，说明苏丹Ⅳ与鲱鱼精DNA 的相互作用是通过沟槽结合实现的［15］。

3 结论

在pH 值为7.4的Tris－HCl缓冲溶液中，采用荧光光谱法研究了苏丹Ⅳ与鲱鱼精DNA 的相互作用。结果表明，苏丹Ⅳ通过沟槽结合模式与鲱鱼精DNA发生作用；鲱鱼精DNA 能猝灭苏丹Ⅳ的内源性荧光，其机理属于静态猝灭。通过Scatchard方程求得不同温度下的结合常数和结合位点数，热力学参数数据表明，苏丹Ⅳ与鲱鱼精DNA 之间的主要作用力为氢键和范德华力。

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