荧光光谱法研究盐酸二甲双胍与牛血清白蛋白的相互作用

（湖北科技学院药学院，湖北咸宁443100）

二甲双胍属双胍类胰岛素增敏剂，其药用形式为盐酸二甲双胍（metformin hydrochloride），化学名为1，1－二甲基双胍盐酸盐（N，N－dimethylimidodicarbonimidic diamide hydrochloride），易溶于水［1］。临床上主要用于仅由饮食控制无效的轻、中度Ⅱ型糖尿病，特别有利于治疗肥胖或者超重的Ⅱ型糖尿病，亦可用于非肥胖型糖尿病的初步治疗［2］。

血清白蛋白是血浆中最丰富的蛋白质，且结构简单，可与许多内源性或者外源性化合物发生相互作用，并对这些物质在生物体内的存储与转运发挥重要作用［3－4］。牛血清白蛋白（BSA）与人血清白蛋白（HSA）的结构高度相似，二者的氨基酸序列也高度相似，而且BSA 的价格便宜，因此人们常常研究药物与BSA 的结合情况，作为与HSA 结合情况的参考［5－6］。

有关双胍类胰岛素增敏剂与BSA 的作用机理的研究少有报道，研究盐酸二甲双胍与BSA 的相互作用对于探索双胍类胰岛素增敏剂的临床用药以及药物剂型的改良具有重要的指导意义。

1 实验

1.1 试剂与仪器

盐酸二甲双胍对照品（含量100%，以C4H11N5·HCl计），中国食品药品检定研究院；BSA，中国科学院化学研究所；三羟甲基氨基甲烷（Tris），上海伯奥生物科技有限公司；氯化钠、硫酸铜、乙酸镁，分析纯；实验用水为二次蒸馏水。

PHS－3C 型酸度计，上海仪电科学仪器股份有限公司；HH－4型数显恒温水浴锅，常州市华普达教学仪器有限公司；RF－5301PC 型荧光分光光度计，日本岛津公司。

1.2 方法

1.2.1 盐酸二甲双胍对BSA 的荧光猝灭作用

分别在29℃、33℃、37℃下，称取适量BSA 溶于pH＝7.4的Tris－HCl缓冲溶液（含适量NaCl），配制成1×10－5mol·L－1的BSA 溶液。在1cm 比色皿中加入2 mL 上述BSA 溶液，每次加入浓度为0.122 mol·L－1的盐酸二甲双胍水溶液30μL，保温5min，再以λex为282nm，激发和发射狭缝宽度分别为10 nm、5nm，在300～500nm 范围内扫描荧光光谱，得盐酸二甲双胍对BSA 的荧光猝灭光谱。

1.2.2 盐酸二甲双胍对BSA 荧光猝灭类型的确定

盐酸二甲双胍对BSA 的荧光猝灭类型先按动态猝灭的Stern－Volmer方程处理［7］，对于不同的温度，分别以F0／F－1对盐酸二甲双胍溶液的浓度c作图。求得563K、567K、571K 时的线性回归方程、相关系数、动态猝灭常数（KSV）、动态猝灭速率常数（Kq）。

1.2.3 盐酸二甲双胍与BSA 相互作用的热力学参数和作用力类型分析

反应的焓变（ΔH）、自由能（ΔG）和熵变（ΔS）三者之间的关系式为：

式中：K类似于相应温度下的Stern－Volmer方程中的KSV。

以lnK对1／T作图得到直线，由直线截距和斜率可求出ΔS、ΔH，同时根据式（2）可求算ΔG。

1.2.4 盐酸二甲双胍与BSA 相互作用的结合常数与结合位点数的计算

生物大分子与药物小分子相互作用的结合常数Ka、结合位点数n和猝灭剂浓度c之间满足方程：

以lg（F0／F－1）对lgc进行线性回归，由直线截距和斜率可求出盐酸二甲双胍与BSA 相互作用的结合常数Ka及结合位点数n。

1.2.5 金属离子对盐酸二甲双胍与BSA 相互作用的影响

同1.2.1方法测定比色皿中分别加入浓度为5×10－3mol·L－1的乙酸镁、硫酸铜溶液4μL 时盐酸二甲双胍对BSA 的荧光猝灭光谱。

2 结果与讨论

2.1 盐酸二甲双胍对BSA的荧光猝灭作用

不同浓度盐酸二甲双胍对BSA 的荧光猝灭光谱如图1所示。

由图1可知，随着盐酸二甲双胍浓度的增加，BSA的内源性荧光强度逐渐减弱，峰位置和峰形基本保持恒定。表明盐酸二甲双胍能猝灭BSA 的内源性荧光，二者之间有相互作用。

2.2 盐酸二甲双胍对BSA的荧光猝灭类型

不同温度下，盐酸二甲双胍对BSA 的（F0／F－1）～c曲线的线性回归方程、相关系数、KSV及Kq如表1所示。

图1 不同浓度盐酸二甲双胍对BSA的荧光猝灭光谱Fig.1 Fluorescence quenching spectra of BSA with different concentrations of metformin hydrochloride

表1 盐酸二甲双胍对BSA的（F0／F－1）～c曲线的线性回归方程、相关系数、KSV及KqTab.1 Regression equations，correlation coefficients，KSVand Kqof（F0／F－1）～c curve for BSA with metformin hydrochloride

由表1 可知，随着温度的升高，盐酸二甲双胍对BSA 的猝灭常数KSV升高，表明荧光猝灭的类型为分子扩散和碰撞所引起的动态猝灭。通常情况下认为，各种荧光猝灭剂对生物大分子的动态猝灭速率常数的最大值约为2.0×1010L·mol－1·s－1。本实验563 K、567K、571K 时盐酸二甲双胍对BSA 的动态猝灭速率常数Kq分别为7.212×108L·mol－1·s－1、7.926×108L·mol－1·s－1、9.227×108L·mol－1·s－1，均小于2.0×1010L·mol－1·s－1，进一步证实了盐酸二甲双胍与BSA 的相互作用具有显著的动态猝灭特征。

2.3 相互作用的热力学参数和作用力类型

不同温度下，盐酸二甲双胍对BSA 的lnK～1／T曲线如图2所示。盐酸二甲双胍与BSA 相互作用的热力学参数见表2。

由表2可知：ΔG为负值，表明盐酸二甲双胍与BSA 相互作用的过程是自发进行的；ΔH＞0且ΔS＞0，根据Ross的生物大分子与小分子作用力类型理论［8］，盐酸二甲双胍与BSA 之间的作用力主要表现为疏水作用力。

图2 563K、567K、571K 下盐酸二甲双胍对BSA的lnK～1／T 曲线Fig.2 The lnK～1／Tcurves of BSA with metformin hydrochloride at 563K，567K，571K

表2 563K、567K、571K 下盐酸二甲双胍与BSA相互作用的热力学参数Tab.2 Thermodynamic parameters of interaction between metformin hydrochloride and BSA at 563K，567K，571K

2.4 结合常数Ka 和结合位点数n

不同温度下，盐酸二甲双胍对BSA 的lg（F0／F－1）～lgc曲线的线性回归方程、相关系数、lgKa、Ka和n见表3。

表3 563K、567K、571K 盐酸二甲双胍对BSA的lg（F0／F－1）～lgc曲线的线性回归方程、相关系数、lgKa、Ka 和nTab.3 Regression equations，correlation coefficients，lgKa，Kaand nof BSA with metformin hydrochloride for lg（F0／F－1）～lgc curve at 563K，567K，571K

由表3可知：盐酸二甲双胍与BSA 的结合位点数n的平均值为0.9206，表明两者之间形成了一个结合位点；随着温度的升高，结合常数Ka逐渐增大，这可能是由于温度的升高使药物小分子和蛋白质分子之间的分子扩散和碰撞增强，从而导致了结合常数的增大。

2.5 金属离子的影响

根据Stern－Volmer方程测得：571 K 时，有、无Cu2＋存在的情况下，KSV（Cu2＋）／KSV＝0.602、Ka（Cu2＋）／Ka＝0.165；有、无Mg2＋存在的情况下，KSV（Mg2＋）／KSV＝0.737、Ka（Mg2＋）／Ka＝0.441。表明Cu2＋、Mg2＋的存在降低了药物和BSA 的动态猝灭常数KSV和结合常数Ka。同时，在Cu2＋、Mg2＋存在下的ΔG分别为－4.42kJ·mol－1、－4.94kJ·mol－1，较盐酸二甲双胍与BSA 相互作用时的ΔG（－5.73kJ·mol－1）大，进一步说明了Cu2＋、Mg2＋的存在使盐酸二甲双胍与BSA 的动态猝灭作用更难发生。原因可能是金属离子的存在导致药物与蛋白质结合的紧邻区域构型发生改变，从而削弱了药物与蛋白质的结合，使药物对BSA 的荧光猝灭作用减弱［9］。

3 结论

采用荧光光谱法研究盐酸二甲双胍与牛血清白蛋白（BSA）的相互作用以及常见金属离子对盐酸二甲双胍和BSA 相互作用的影响。结果表明：盐酸二甲双胍对BSA 的荧光猝灭为动态猝灭，两者之间的作用力类型为疏水作用力；随着温度的升高，盐酸二甲双胍与BSA 的结合常数增大，表明温度的升高有利于盐酸二甲双胍对BSA 的动态猝灭作用；在Cu2＋、Mg2＋存在下，盐酸二甲双胍与BSA 的动态猝灭常数KSV和结合常数Ka均降低，表明Cu2＋、Mg2＋的存在不利于盐酸二甲双胍与BSA 的结合，削弱了二者的相互作用。

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