藤茶总多酚提取工艺优化及生物活性初步研究

陈忠正，陈银烨，魏超田，李晓玲，张媛媛，李斌

（华南农业大学食品学院，广东广州510642）

藤茶总多酚提取工艺优化及生物活性初步研究

陈忠正，陈银烨，魏超田，李晓玲，张媛媛，李斌*

（华南农业大学食品学院，广东广州510642）

以藤茶为材料，通过单因素和正交试验，优化了总多酚热水提取工艺，采用DPPH法测定了其抗氧化活性，以小鼠巨噬细胞Raw 264.7为模型，测定了其抗炎活性。结果表明，藤茶总多酚的最佳提取条件为提取时间1.5 h、提取温度100℃、料液比1∶25（g/m L），此时总多酚得率为28.61%。藤茶水提物对DPPH自由基有良好的清除效果，同时具有一定的抗炎活性，并呈现明显的量效关系。

藤茶；总多酚；提取工艺；生物活性

藤茶[Ampelopsis grossedentata（Hand.Mazz）W.T. Wang]是葡萄科、蛇葡萄属的一种野生藤本植物[1]，又名甜树茶、甜茶藤、茅岩霉茶、山甜茶、甘露茶、白毛猴、白茶等，其幼嫩茎叶中含有丰富的多酚、黄酮类化合物、多糖、氨基酸、维生素等[2]。近代药理研究表明，藤茶及其提取物具有抑菌、降血脂、降血压、抗氧化、抗血栓、抗肿瘤、降血糖、抗炎镇痛、保肝护肝以及减轻乙醇中毒等功效[3-9]。多酚是其药理功能的一类重要成分，但是目前关于藤茶的研究主要集中在藤茶的栽培、繁育及黄酮类化合物的功能活性等方面，而对藤茶的多酚类物质研究较少。本文主要对藤茶多酚的提取工艺进行了优化，并测定了藤茶水提物的抗氧化和抗炎活性，旨在为藤茶资源的综合开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

藤茶：广州市售；小鼠巨噬细胞Raw 264.7，购于美国模式培养物储存库（ATCC）。

没食子酸：天津市大茂化学试剂厂；碳酸钠、福林酚：均为分析纯；DPPH自由基：日本东京化成工业株式会社；胎牛血清（FBS）、青霉素和链霉素购于Life公司；脂多糖购于Sigma公司；Griess试剂盒，购于Promega公司；DMEM（无酚红）培养基、L-谷氨酰胺购于Hyclone公司。

1.2 方法

1.2.1 藤茶总多酚的提取

1.2.1.1 藤茶总多酚提取单因素实验

1）提取时间：设定提取温度为80℃，料液比1∶30（g/m L），提取时间分别为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h。

2）提取温度：设定料液比1∶30（g/mL）、提取时间1.5 h，分别于60、70、80、90、100℃提取藤茶总多酚。

3）料液比：设定提取时间1.5 h，提取温度100℃，在1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶30（g/mL）不同料液比下提取藤茶总多酚。

1.2.1.2 藤茶总多酚提取正交试验

采用L9（34）试验设计进行三因素三水平正交试验，如表1所示。

表1 藤茶总多酚提取正交唐君,刘靖,等.紫山药的引种与标平Table 1 Factors and levels of orthogonal array design

1.2.2 藤茶总多酚的测定

福林酚比色法[10]。标准曲线为y=0.004 8x+0.005 8，R2=0.998 5。

1.2.3 藤茶水提物的提取

以一级水作为溶剂提取藤茶样品，经旋转蒸发浓缩、冷冻干燥、氮吹干燥等制成初提取样品。

1.2.4 藤茶样品对DPPH自由基清除率的测定

将藤茶水提取样品倍比稀释为质量浓度：100.00、50.00、…、3.13μg/mL。分别取各浓度测试液100μL和DPPH溶液100μL混合，其他处理及测定与计算参考文献方法[8]。

1.2.5 NO抑制率测定

1）接种细胞：取小鼠巨噬细胞Raw 264.7接种于96孔板，每孔5×105细胞/m L，于37℃、含5%的CO2培养箱中培养24 h；

2）加样：弃去旧培养液，添加100μL藤茶不同浓度提取物的新鲜培养液，100μL的脂多糖溶液，混匀，培养24 h；

3）测定：取出96孔板，取100μL培养液到新的96孔板，向新96孔板加入Griess试剂A液和B液，用酶标仪测定542 nm吸光值。

以上实验均重复3次，取平均值。

2 结果与分析

2.1 藤茶总多酚提取工艺参数的确定

2.1.1 提取时间对藤茶总多酚提取效果的影响

本实验固定提取温度为80℃，料液比1∶30，分别提取不同时间，藤茶总多酚得率如图1所示。

图1 提取时间对藤茶总多酚得率的影响Fig.1 Effect of extraction time on extraction efficiency of total polyphenols from Ampelopsis grossedendata

由图1可知，藤茶总多酚得率随提取时间的延长呈上升趋势，当提取时间达到1.5 h后，总多酚得率没有明显变化。多重比较结果表明，1.5 h的总多酚得率与2.0、2.5、3.0 h均无显著差异。本着节能、省时原则，选择1.5 h为后续提取实验参数。

2.1.2 提取温度对藤茶总多酚提取效果的影响

本实验固定料液比1∶30（g/mL）、提取时间1.5 h，在不同温度下提取藤茶总多酚，结果如图2所示。

图2 提取温度对藤茶总多酚得率的影响Fig.2 Effect of extraction temperature on extraction efficiency of total polyphenols from Ampelopsis grossedendata

由图2可见，藤茶总多酚得率随温度升高而增加。在60℃～80℃之间，总多酚得率增长较快，当温度达80℃后，总多酚得率增长变缓，当温度为100℃时，总多酚得率达最大值。多重比较结果表明，90℃与100℃之间无显著差异，因沸腾状态的水易于控制温度，故后续实验以100℃为提取温度。

2.1.3 料液比对藤茶总多酚提取效果的影响

本实验固定提取时间1.5 h，提取温度100℃，在不同料液比下提取藤茶总多酚，结果如图3所示。

由图3可以看出，藤茶总多酚得率随溶剂用量增加而增加。当料液比达到1∶20g/mL后，总多酚得率变化不明显。ANOVA分析表明，1∶20（g/m L）与1∶25（g/m L）、1∶30（g/mL）和1∶35（g/mL）的总多酚得率之间均无显著差异，故选择茶水比1∶20（g/mL）为后续实验提取参数。

图3 料液比对藤茶总多酚得率的影响Fig.3 Effect of material/liquid ratio on extraction efficiency of total polyphenols from Ampelopsis grossedendata

2.1.4 藤茶总多酚最佳提取工艺参数的优选

在单因素实验基础上，采用L9（34）正交试验设计进行提取时间、提取温度和料液比的正交试验，结果如表2所示。

表2 藤茶总多酚提取正交试验设计与结果Table2 Scheme and experimental results of orthogonal array design

表2极差分析显示，影响藤茶总多酚提取效果的因素依次为提取温度＞提取时间＞料液比，综合实验结果得出藤茶总多酚的最佳工艺组合为A2B3C2，即料液比1∶25（g/mL）、时间1.5 h、温度100℃。在最佳工艺条件下进行3次平行实验，藤茶总多酚得率平均值为（28.61±0.03）%，与正交试验结果相符。

2.2 藤茶水提物生物活性研究

2.2.1 藤茶水提物对DPPH自由基的清除效果

本实验将藤茶水提物进行DPPH自由基清除能力分析，结果如图4所示。

图4 藤茶总多酚对DPPH自由基的清除效果Fig.4 Scavenging capability of total polyphenols from Ampelopsis grossedendata on DPPH free radicals

藤茶水提物对DPPH自由基清除效果明显，且呈明显的量效关系。

2.2.2 藤茶水提取物抑制NO的活性

将藤茶水提物配成1 mg/mL的初始质量浓度并进行倍比稀释，测定其抑制NO活性，结果如图5所示。

图5 藤茶粗提物诱导抑制NO效果Fig.5 NO inhibiting activities of crude extracts from Ampelopsis grossedendata

藤茶水提物具有抗炎活性，随着浓度升高，其抑制率上升，在浓度为1 000μg/mL时，抑制NO活性达到50%，呈现量效关系。

3 结论

本研究通过单因素和正交试验得到藤茶总多酚的最佳提取工艺为：提取时间1.5 h、提取温度100℃、料液比1∶25，在此工艺条件下，藤茶总多酚的提取率可达到28.61%。藤茶水提物具有较好的抗氧化能力，对DPPH自由基具有良好的清除效果，并表现出明显的量效关系；采用小鼠巨噬细胞Raw 264.7模型体外测定表明，藤茶水提物具有一定的抗炎作用。这一研究结果，为进一步开展藤茶总多酚的开发利用及功能性饮料的开发打下了前期的研究基础。

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Extraction of Total Polyphenols from Ampelopsis grossedentata and the Biological Activity of Water Extracts

CHEN Zhong-zheng，CHEN Yin-ye，WEI Chao-tian，LI Xiao-ling，ZHANG Yuan-yuan，LI Bin*
（College of Food Science，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，Guangdong，China）

The water extraction of total polyphenols from Ampelopsis grossedentata and the biological activity of its extracts were studied.The results showed that the optimal extraction conditions were achieved to be extraction at 100℃for 1.5 h with a 25-fole volume of water as the extraction solvent.Under the optimal extraction conditions，the yield of total polyphenols was 28.61%.The water extracts of Ampelopsis grossedentata showed high reducing power and excellent scavenging effect on DPPH free radicals in a dosedependent manner，and also showed some activity on anti-inflammatory.

Ampelopsis grossedentata；total polyphenols；extraction conditions；biological activity

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.03.006

2013-07-26

现代农业产业技术体系建设专项资金(CARS-23)

陈忠正（1974—），男（汉），副教授，博士，研究方向：食品科学、食品生物技术等。

*通信作者：李斌（1960—），女，教授，博导，博士，研究方向：食品化学与营养。