慢性间歇低氧对大鼠肝细胞IRS-2、FoxO1表达的影响

李娜娜 任寿安

·论著·

慢性间歇低氧对大鼠肝细胞IRS-2、FoxO1表达的影响

李娜娜 任寿安

目的观察慢性间歇低氧条件下,大鼠肝细胞形态学变化及胰岛素受体底物-2(IRS-2)、叉头框蛋白O1(FoxO1)的蛋白表达，并探讨IRS-2、FoxO1与胰岛素抵抗的相关性。方法取24只6周龄健康雄性Sprauge-Dawley大鼠，采用随机数字表法分为正常对照组(NC组)、慢性间歇低氧4周组(CIH4组)、慢性间歇低氧8周组(CIH8组)，每组8只。CIH4组和CIH8组暴露于间歇低氧舱内：最低氧浓度6%～8%，持续时间8 h/d。NC组无间歇低氧暴露正常饲养，CIH4组、CIH8组和NC组分别于第4周、第8周及第8周禁食12 h后测定空腹血糖、空腹胰岛素水平，并采用稳态模型评估-胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)和胰岛素敏感性指数(ISI)评价胰岛素抵抗，对肝组织行HE染色观察形态学变化，采用免疫组织化学方法测定肝细胞IRS-2、FoxO1蛋白表达,以平均灰度值表示其蛋白表达量,二者成反比关系。结果与NC组相比，CIH4组、CIH8组空腹血糖、胰岛素、HOMA-IR升高，ISI降低，且CIH8组更为显著，差异有统计学意义(F=50.23～90.26，P均<0.05)。与NC组相比，CIH4组与CIH8组IRS-2蛋白表达降低，FoxO1蛋白表达增高且在核内重新分布，CIH8组更为显著，差异有统计学意义(F=69.46，618.94，P均<0.05)。Pearson相关分析显示：HMOA-IR与IRS-2平均灰度值呈正相关(r=0.857,P<0.05)，与FoxO1平均灰度值呈负相关(r=-0.926,P<0.05)，ISI与IRS-2平均灰度值呈负相关(r=-0.823,P<0.05)，与FoxO1平均灰度值呈正相关(r=0.848,P<0.05)。结论慢性间歇低氧条件下，大鼠肝细胞受损并发生胰岛素抵抗，同时IRS-2和FoxO1蛋白表达异常，且随暴露时间延长肝细胞损伤程度及胰岛素抵抗程度均逐渐加重。

慢性间歇低氧；IRS-2；FoxO1；胰岛素抵抗

阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(OSAHS)是一种常见的睡眠障碍性疾病,以患者睡眠中反复发生上气道完全和(或)不完全阻塞导致呼吸暂停或低通气为特征，其关键的病理生理机制是慢性间歇低氧(CIH)[1]。近年来，人们逐渐认识到OSAHS不仅对睡眠有影响，而且与心脑血管疾病、高血压、2型糖尿病及由睡眠不足引起的突发事件密切相关[2]。关于OSAHS与2型糖尿病之间的联系，国外研究显示，OSAHS 患者中2型糖尿病的患病率超过40%，而2型糖尿病患者中OSAHS的患病率约为23%[3]。肝脏糖代谢紊乱对机体胰岛素抵抗的发生具有重要意义。当OSAHS患者处于低氧状态时，葡萄糖有氧代谢减少，无氧酵解增加，部分丙酮酸未经氧化还原成乳酸，进入肝脏转化成糖，血糖随之升高。高血糖、高胰岛素血症、肝脂肪变、氧化应激以及胰岛素信号转导异常等都是胰岛素抵抗发生的机制，而胰岛素信号转导异常是形成胰岛素抵抗的必要条件。本实验通过构建CIH模型，观察大鼠肝细胞形态学变化及胰岛素信号分子胰岛素受体底物(IRS)-2、叉头框蛋白O1(FoxO1)的蛋白含量变化，探讨CIH通过胰岛素信号转导途径参与胰岛素抵抗的发生机制，进一步阐述OSAHS与2型糖尿病之间的关系，为 OSAHS合并2型糖尿病的发病机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与饲料 24只6周龄健康雄性Sprauge-Dawley大鼠，体重(170±10)g，自由饮水，普通饲料喂养。实验动物及饲料由山西医科大学实验动物中心提供。

1.2 实验主要试剂及仪器设备 便携式测氧仪AX-300 (A Teledyne Technologies Company英国公司)；氮气、氧气减压表 (上海仪表厂)；电磁阀门JB-16(荷兰)；血糖仪AW06336402B、血糖试纸 (美国强生医疗器械公司)；KB3127A大鼠胰岛素ELISA试剂盒(海凯博生化试剂有限公司)；MK3型全自动中文酶标仪(上海雨晨生物技术有限公司)；IRS-2、FoxO1免疫组化一抗(北京博奥生物技术有限公司)；SABC二步法免疫组化试剂盒 (武汉博士德生物工程有限公司)；石蜡切片机、烘片机(LEICA)。

1.3 实验方法

1.3.1 实验分组 采用随机数字表法将大鼠分为正常对照组(NC组)、CIH4周组(CIH 4组)、CIH 8周组(CIH8组)，每组8只。

1.3.2 模型制备 间歇低氧舱制备：有机密封玻璃箱体积65 cm×45 cm×50 cm，舱体两侧各两气孔用以保持气压恒定，舱内安装测氧仪。由尼龙抗压管将玻璃舱和外面的氮气瓶、氧气瓶及控制系统相连接。充气模式如下：先充氮气45 s,舱内氧浓度由21%降至(7±1)%持续10 s；接着充入氧气45 s，使舱内氧浓度逐渐恢复至21%，再持续10 s，循环一次持续110 s。模型建立方案：将CIH4组和CIH8组置于间歇低氧舱内，自由饮水进食，每天持续8 h，NC组呼吸正常空气。CIH4组与CIH8组分别于4周、8周后停止间歇低氧暴露。

1.3.3 标本取材 将NC组、CIH4组、CIH8组大鼠分别于第4周、第8周及第8周禁食12 h称重、测血糖、腹腔麻醉、腹主动脉采血，离心机离心10 min (3 000 r/min，r=190 mm)，取上层血清液放于-80℃冰箱备用；取肝组织浸泡于4%甲醛液48 h，石蜡包埋,免疫组织化学备用。

1.4 检测指标

1.4.1 空腹血糖检测 大鼠称重后分别取微量尾尖血滴于强生血糖仪配套试纸上，葡萄糖氧化酶法测血糖值，每只大鼠均测1次。

1.4.2 空腹血清胰岛素检测 采用双抗体两步夹心酶联免疫吸附法，将标准品、大鼠血清加入到预先包被大鼠胰岛素多克隆抗体透明酶标包被板中，37℃温育，洗涤，加酶标工作液，再37℃温育，洗涤。依次加入底物A、B，加终止液后颜色由蓝色转变为黄色，用酶标仪450 nm波长下测定OD值，根据标准品和所测大鼠胰岛素的OD值，计算各组血清胰岛素含量。

1.4.3 评估胰岛素抵抗程度 采用稳态模型评估-胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)=(空腹血糖×空腹胰岛素)/22.5；胰岛素敏感指数(ISI)=1/(空腹血糖×空腹胰岛素)来评价胰岛素抵抗。

1.4.4 IRS-2、FoxO1表达的检测 采用SABC二步免疫组织化学方法：肝组织石蜡标本切片，60℃烤箱过夜；次日脱蜡，3%H2O2封闭15 min灭活内源性过氧化物酶，蒸馏水、PBS各洗3次×5 min；高温、高压下枸橼酸钠缓冲液热修复抗原，自然冷却，PBS洗3次×5 min；5%BSA液封闭抗原，37℃孵育箱内孵育30 min；加兔抗大鼠IRS-2、FoxO1一抗(浓度分别1∶100、1∶150)，4℃冰箱过液；次日室温下复温30 min，PBS洗3次×5 min；加山羊抗兔二抗，室温下20 min，PBS洗3次×5 min；加SABC室温下20 min,PBS洗3次×5 min,避光下DAB显色，光镜下控制反应时间，自来水终止显色反应；苏木素复染30 s，盐酸酒精分化、水洗、氨水中反蓝色；梯度乙醇水化，二甲苯透明，中性树胶封片。切片置于显微镜下观察、拍照，利用Image-Pro Plus图像软件进行灰度定量分析。

1.4.5 肝细胞形态观察 采用苏木素-伊红(HE)染色法观察各组大鼠肝细胞形态学变化。

2 结果

2.1 血糖、胰岛素及胰岛素抵抗的结果 与NC组相比，CIH4组和CIH8组血糖、胰岛素及HOMA-IR均升高，ISI降低，差异有统计学意义(P均<0.05)，且CIH8组最为显著(P<0.05)，见表1。

2.2 肝细胞IRS-2及FoxO1的表达 IRS-2主要在肝细胞胞质中表达，棕黄色颗粒呈散在或局灶状分布，而汇管区内皮细胞胞质表达更为明显(图1，封3)。图像扫描分析显示：与NC组相比，CIH4组和CIH8组肝细胞中IRS-2平均灰度值逐渐增加，蛋白表达水平逐渐降低，差异有显著性(P均<0.05)；NC组FoxO1蛋白主要在肝细胞胞质的表达呈散在分布的棕黄色颗粒，细胞核内几乎没有表达，而CIH4组和CIH8组FoxO1在细胞核内表达，核内呈棕黄色，图像分析显示：CIH4组、CIH8组FoxO1蛋白表达水平高于NC组，差异有显著性(P均<0.05)，CIH4组与CIH8组相比，差异亦有统计学意义(P<0.05)，见表2，图2(封3)。

表1 各组血糖、胰岛素、胰岛素抵抗指标比较

注：与NC组相比，aP<0.05；与CIH4组相比，bP<0.05；与CIH8组相比，cP<0.05；HOMA-IR：稳态模型评估-胰岛素抵抗指数；ISI：胰岛素敏感指数；NC组：正常对照组：CIH4组：慢性间歇低氧4周组；CIH8组：慢性间歇低氧8周组

表2 各组IRS-2、FoxO1蛋白平均灰度值比较

注：与NC组相比，aP<0.05；与CIH4组相比，bP<0.05；与CIH8组相比，cP<0.05；IRS-2：胰岛素受体底物-2；FoxO1：叉头框蛋白O1；NC组：正常对照组：CIH4组：慢性间歇低氧4周组；CIH8组：慢性间歇低氧8周组

2.4 相关性分析 HMOA-IR与IRS-2的平均灰度值呈正相关(r=0.857，P<0.05)，而与FoxO1的平均灰度值呈负相关(r=-0.926，P<0.05)，ISI与IRS-2的平均灰度值呈负相关(r=-0.823，P<0.05)，与FoxO1的平均灰度值呈正相关(r=0.848，P<0.05)。

3 讨论

近年来OSAHS合并糖尿病已成为研究者们关注的焦点，对其发病机制的研究可为临床工作者提供进一步的帮助。CIH是OSAHS主要的发病机制，而贯穿2型糖尿病整个发病过程中重要的病理生理机制是胰岛素抵抗。其中肝脏的胰岛素抵抗在2型糖尿病中起主导作用[4]。肝脏发生胰岛素抵抗时，一方面可导致肝糖输出增加，引起空腹高血糖和高胰岛素血症；另一方面肝脏游离脂肪酸蓄积，游离脂肪酸作用于肝细胞内胰岛素信号转导途径，使胰岛素抵抗程度加重。

OSAHS患者随着病情加重，夜间缺氧再氧合的次数不断增加，这种缺氧再氧合相当于缺血再灌注，可以引起细胞内活性氧簇增加，超量的活性氧簇是细胞和分子损伤的罪魁祸首，从而破坏了原有抗氧化系统的平衡，引起氧化应激[5]。活性氧簇主要攻击含有丰富线粒体的肝脏，改变肝细胞膜及亚细胞器的结构，导致肝细胞损伤、坏死、凋亡[6]。另外活性氧簇和过氧化物还可以激活前炎性转录因子核因子-κB及其所介导的炎性反应通路，核因子-κB依赖的炎性细胞因子出现过表达，氧化应激与炎性反应共同启动，相互刺激并加强，从而产生大量自由基和过氧化物酶体，造成肝细胞损害，导致肝细胞变性、坏死、炎细胞浸润等。同时破坏胰岛素信号转导通路，造成胰岛素抵抗和代谢紊乱[7-8]。本实验观察到CIH大鼠肝细胞胞膜破坏、胞质稀疏、细胞水肿、核轻度深染及炎细胞浸润，并随暴露时间的延长肝细胞结构破坏程度加重。考虑CIH条件下，肝细胞的损伤可能与氧化应激及全身炎性反应相关。

胰岛素信号转导异常在胰岛素抵抗过程中起关键作用。胰岛素主要通过磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)途径调节糖代谢。该通路中任何环节受到干扰均会影响胰岛素的信号转导，使葡萄糖表达和转运受限，最终导致血糖升高。IRS-2和FoxO1分别是PI3K信号通路上、下游重要的转录因子。目前IRS家族包括IRS-1、2、3、4，IRS-1在骨骼肌大量表达，IRS-2主要在肝脏和胰岛β细胞表达，可调节肝脏胰岛素活性，促进肝糖原合成和抑制肝糖输出。IRS-2低表达或磷酸化异常可能是胰岛素通过肝脏IRS-2/PI3K信号转导途径导致肝脏胰岛素抵抗加重的主要原因[9]。Valverde等[10]研究发现，敲除IRS-2基因的小鼠肝细胞PI3K活性与野生型鼠相比降低50%左右，造成下游信号分子磷酸化障碍，并且无法通过增加IRS-1蛋白含量或者提高酪氨酸磷酸化进行代偿。还有类似研究表明，一旦IRS-2的表达出现异常，机体将很快出现糖尿病样症状[11]。本实验研究显示，与NC组相比，CIH4组及CIH8组肝细胞IRS-2蛋白表达明显减少，且CIH8组更为显著，表明CIH条件下IRS-2在肝细胞中表达受抑制。同时发现IRS-2的平均灰度值与HMOA-IR呈正相关、与ISI呈负相关，说明IRS-2蛋白表达量与HOMA-IR呈负相关，而与ISI呈正相关，CIH条件下大鼠肝细胞IRS-2蛋白表达受抑制，胰岛素信号通路活化减少，从而发生胰岛素抵抗，且随暴露时间延长抵抗程度加重。

FoxO1是Forkhead基因家族O亚家族中发现最早的成员，广泛表达于肝脏、 胰腺、肾脏和骨骼肌等多种组织器官。FoxO1可调节糖、脂代谢相关基因的表达，激活肝糖合成。其在肝脏中最主要的生物学效应是激活磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶及葡萄糖-6磷酸酶[12]。正常生理状态下进食后伴随胰岛素的释放，蛋白激酶B可使FoxO1磷酸化，使其从细胞核转移到细胞质，转录活性受到抑制，进而抑制肝脏糖异生，降低血糖。如果FoxO1表达异常会影响正常的肝糖输出，同时可能降低游离脂肪酸代谢酶的活性，使细胞内脂肪堆积，导致肝脏胰岛素抵抗的发生[13]。本实验发现NC组FoxO1在胞质中表达多，而CIH4组及CIH8组FoxO1表达部位从胞质转移到核内，且表达量逐渐增加。相关性分析提示FoxO1的平均灰度值与HMOA-IR呈负相关、与ISI呈正相关。表明FoxO1蛋白表达量与HOMA-IR呈正相关，而与ISI呈负相关，随CIH暴露时间延长，大鼠肝细胞FoxO1表达逐渐上调且在核内重新分布，胰岛素抵抗程度加重。有研究已证实，当暴露于氧化应激或高血糖环境下，FoxO1没有被磷酸化，就会在核内重新分布发挥作用[14]。而在胰岛素抵抗状态下FoxO1的表达及活性也会明显增加，在各组织器官细胞核内FoxO1的分布增多，转录活性激活，导致肝糖输出增加，血糖升高。由此推测，FoxO1是氧化应激与胰岛素抵抗间一个重要的连接点。进一步说明，CIH与胰岛素信号通路及胰岛素抵抗之间存在相关性。

综上所述，CIH可能通过氧化应激、全身炎性反应等机制，破坏肝细胞，且影响胰岛素信号通路相关分子，使胰岛素信号转导异常，最终导致胰岛素抵抗的发生。提示胰岛素信号转导途径在OSAHS并发胰岛素抵抗过程中起着桥梁作用。从临床角度出发，IRS-2和FoxO1可能成为OSAHS合并2型糖尿病治疗和干预的潜在靶点，为临床诊治拓展思路。

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EffectsofchronicintermittenthypoxiaonIRS-2andFoxO1expressioninratheptocytes

LiNana*,RenShouan.

*ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China

ObjectiveTo observe the histomorphologic alteration and expression of insulin receptor substrate (IRS)-2 and FoxO1 in rat heptocytes, and investigate the association of IRS-2 and FoxO1 with insulin resistance induced by chronic intermitted hypoxia.MethodsTwenty-four healthy male Sprauge-Dawley rats at 6-week age were divided into normal control group (NC group), chronic intermittent hypoxia for 4 weeks group (CIH4 group) and chronic intermittent hypoxia for 8 weeks group (CIH8 group) according to random number table, with 8 rats in each group. CIH4 group and CIH8 group were placed in intermittent low oxygen cabin for 8 hours per day, the minimum oxygen concentration was 6%-8%. NC group was placed in normal air cabin. Fasting blood glucose and fasting insulin level were measured on 4th week, 8th week and after an overnight fast of 12 hours on 8th week in CIH4, CIH8 and NC group, respectively. Homeostatic model assessment of insulin resistance index (HOMA-IR) and insulin sensitive index (ISI) were used to evaluate insulin resistance. HE staining was used for morphologic study of liver. IRS-2 and FoxO1 expression in heptocytes were analyzed by immunohistochemistry. Average gray value was used to represent the protein expression, and which was inversely proportional to average gray value.ResultsCompared with NC group, CIH4 and CIH8 group had elevated fasting blood glucose, fasting insulin, HOMA-IR, and reduced ISI, especially in CIH8 group (F=50.23-90.26, allP<0.05). Compared with NC group, the expression of IRS-2 decreased in CIH4 and CIH8 group；the expression of FoxO1 increased in CIH4 and CIH8 group with the re-distribution in the nucleus, especially in CIH8 group(F=69.46,618.94, allP<0.05).Pearsoncorrelation analysis showed that HOMA-IR was positively correlated with the average gray value of IRS-2 (r=0.857,P<0.05), but was negatively correlated with the average gray value of FoxO1 (r=-0.926,P<0.05). ISI was negatively correlated with the average gray value of IRS-2(r=-0.823,P<0.05) and was positively correlated with the average gray value of FoxO1 (r=0.848,P<0.05).ConclusionsIn intermittent hypoxia, the liver is damaged along with the occurrence of insulin resistance and the abnormal expression of IRS-2 and FoxO1, which are aggravated with the exposure time of hypoxia.

Chronic intermittent hypoxia；IRS-2；FoxO1；Insulin resistance(IntJEndocrinolMetab，2015，35：1-5)

10.3760/cma.j.issn.1673-4157.2015.01.001

山西省自然科学基金资助项目(2013011048-4)

030001 太原，山西医科大学(李娜娜)；030001太原，山西医科大学第一医院呼吸科(任寿安)

2014-10-10)