炭黑氨基柱净化HPLC-ICP-MS测定黄酒中砷形态及含量

宋伟华，胡贝贞，韩 超，董文洪

（1.绍兴出入境检验检疫局综合技术服务中心，浙江绍兴312000；2.温州出入境检验检疫局技术中心，浙江温州325000）

炭黑氨基柱净化HPLC-ICP-MS测定黄酒中砷形态及含量

宋伟华1，胡贝贞1，韩 超2，董文洪1

（1.绍兴出入境检验检疫局综合技术服务中心，浙江绍兴312000；2.温州出入境检验检疫局技术中心，浙江温州325000）

建立了一种同时测定黄酒中亚砷酸根、砷酸根、砷甜菜碱、一甲基砷酸和二甲基砷酸等5种砷形态的高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱(HPLC-ICP-MS)分析方法。黄酒经炭黑氨基柱净化，体积分数为10%甲醇水溶液洗脱，采用Hamilton PRP-XIO0阴离子交换色谱柱(4.1 mm×250 mm，10 μm)，60 mmol/L硝酸铵梯度洗脱，高效液相色谱分离，电感耦合等离子体质谱进行定性和定量分析。在0.5～20.0 μg/L范围内各砷形态线性良好，相关系数R均＞0.999；加标回收率85%～92%，相对标准偏差(RSD)1.4%～5.2%；5种砷形态的定量限均为0.10 μg/L，检出限均为0.03 μg/L。利用该方法对不同年份、不同企业及不同类型的黄酒进行了检测，该方法适用于黄酒中砷残留的分析检测。

高效液相色谱；电感耦合等离子体质谱；砷形态；黄酒

砷（As）是一种自然界中广泛存在的元素，大量的砷化物以不同的形态存在于与人类密切相关的水、气和食物中。砷对人的毒性不仅与元素总量有关，还与元素存在的化学形态密切相关[1]，如亚砷酸根（arsenite，AsⅢ）和砷酸根（arsenate，AsV）等无机砷的毒性较大，国际癌症研究委员会已将无机砷列为强致癌性物质，一甲基砷（monomethylated arsenic，MMA）、二甲基砷（dimethylated arsenic，DMA）、砷甜菜碱（arsenobetaine，AsB）和砷胆碱（arsenocholine，AsC）等有机砷毒性很小。因此食品中砷的安全评价，形态分析比总量分析具有更重要的意义。

对食品、中药、沉积物、水等的砷、硒、铅、碘等形态分析已有报道[2-8]，然而由于黄酒的区域性、元素及其形态相关的研究甚少，无论国家标准还是国外标准，均未有相关的规定。李博斌等[9]对黄酒中无机元素成分与黄酒口味品质的定量关系做了研究；程和勇等[10]则对不同风味的黄酒、白酒、啤酒以及葡萄酒中的重金属含量进行了测定；有学者[11]用电感耦和等离子体发射光谱法首次测定了生产黄酒用曲及原料中的K、Na、Ca、Mg、Fe、Mn、Zn、Cu、P、Se等10种人体必需的宏量元素和微量元素，更多的文献则是对黄酒风味和功能的研究。对于黄酒中各元素形态的分析更少，还有学者[12]提到在黄酒这种酸性介质中，无机元素存在状态为有机盐类物质，表现形式为生物活性物质。本实验通过前期的检测工作发现，在黄酒中砷的总量比较高，最高者达56 μg/L，高于饮用水标准对砷的要求。砷的形态不同，其对人体的危害也不一样，如全部为无机砷其毒性则大大增加，因而确定其存在黄酒中的形态就非常重要。目前，测定元素形态方法最常用的是液相或离子色谱与电感耦合等离子体质谱[13]或者荧光光谱[14]的联用。考虑到使用的方便性，本研究建立了炭黑氨基柱净化，高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱（high performance liquid chromatography-inductively coupled plasma mass spectrometry，HPLCICP-MS）测定黄酒中砷形态及其含量，可以明确黄酒中砷存在形态，为监管部门的监管及企业生产工艺的改进和黄酒品质的提高提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

亚砷酸根（AsⅢ）、砷酸根（AsV）、砷胆碱（AsB）、一甲基砷酸（MMA）和二甲基砷酸（DMA）标准品购于中国计量研究院。黄酒样品由绍兴地区黄酒生产企业提供。

试验用水由Milli.Q Element A 10超纯水仪制得，用于配制实验所有标准溶液与样品溶液。硝酸与氨水分别由多功能纯化器纯化后再使用。

60 mm ol/L的硝酸铵：取3.95 m L纯化后的硝酸，定容至1 000 m L，用纯化后的氨水调pH至9.0。

1.2 仪器与设备

Aurora M 90电感耦合等离子体质谱：美国布鲁克.道尔顿公司；Millli-Q ElementA 10超纯水仪：德国Millipore公司；Agilent 1260高效液相色谱仪：美国Agilent公司；Hamilton PRP-X100阴离子交换色谱柱（4.1 mm×250 mm，10 μm）：瑞士汉密尔顿公司；DHJ-8多功能纯化器：美国加州仪器有限公司；炭黑氨基柱（500 mg/6 m L）：杭州福裕科技服务有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品前处理

移取黄酒样品1.0m L，加入已活化好的炭黑氨基柱中，然后以9.0 m L体积分数为10%的甲醇水溶液进行洗脱，收集塑料离心管中用于砷形态的检测。

1.3.2 砷的测定

高效液相色谱（HPLC）条件：色谱柱为Hamilton PRPXI00阴离子交换色谱柱（4.1 mm×250 mm，10 μm）；流动相为60 mmol/L硝酸铵，梯度洗脱：0～2.5 min硝酸铵60%，2.51～3.0 min硝酸铵60%→100%并保持至5.5 min，5.51 min时硝酸铵降至60%，冲洗至7.5 min；流速1.5 m L/m in；柱温为室温；进样体积50 μL。

电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）：射频功率1 400 W；等离子气体流速18 L/m in；辅助气流速1.8 L/m in；鞘气流速0.2 L/m in，雾化器流速：1.0 L/m in，驻留时间（Dwell）：80000μs；碰撞气&辅助气：70m L/min氢气（H2）及140m L/min氮气（N2）。

式中：ω为砷回收率，%；C测为仪器测定砷质量浓度，μg/L；V样为样品体积，m L；C标为标液质量浓度，μg/L；V标为加标体积，μL；C空为空白酒样测定质量浓度，μg/L。

2 结果与分析

2.1 前处理方法的选择及优化

2.1.1 前处理方法的选择

本实验在文献[1-4]的基础上，比较了不同前处理的方法，如直接进样、微波灰化溶解进样、固相萃取柱净化、炭黑氨基柱净化等。结果表明，直接进样方便，但由于黄酒中含有丰富的糖、氨基酸、色素等营养成分，使得谱图基线偏高，且检测再现性差，设备污染严重。微波灰化可以消除掉部分基质的影响，但由于受到灰化温度的限制，导致各形态回收率损失严重。最终选取了炭黑氨基柱净化后洗脱稀释进样的方式进行处理，效果较佳。

2.1.2 前处理方法的优化

黄酒富含氨基酸、蛋白质、糖、色素等多种有机物，对砷（As）在色谱柱上的形态分离会有干扰，同时，高含量的氨基酸、蛋白质等有机物也容易对离子色谱柱造成损伤，因此有必要在样品进色谱柱前进行净化处理。考虑到样品的基质特性，选取对氨基酸、蛋白质及色素有较好吸附能力的炭黑氨基萃取小柱作为净化柱。通过对活化后的炭黑氨基柱的空白洗脱液测试发现，里面含有一定量砷酸根（AsV）的残留，采用25.0 m L超纯水洗脱后，基本能清除残留在净化柱中的砷酸根（AsV）。

1.0 m L空白溶液（含20.0 μg/L的As混标）过净化柱后，分别用9.0 m L纯水、体积分数为5%、10%的甲醇洗脱，收集洗脱液定容至10.0 m L，测定砷的形态及含量，并计算回收率，结果如表1所示。

经过色谱分离，5种形态的砷根据保留时间的不同确定其形态，同时通过质谱扫描得到的峰面积与质量浓度的关系回归校正方程，建立校正曲线，用于回收率及实际样品的测试。砷的回收率计算公式如下：

表1 过柱后的各个砷形态物质的加标回收率Table 1 Standard addition recovery rates of 5 arsenic speciations after elution

由表1可知，无机形态的砷（As3+和As5+）均为无机离子状态，对洗脱溶剂中是否含有甲醇变化不显著，且9.0 m L的洗脱溶剂能基本把目标物洗脱完全。对于有机形态的砷如AsB、MMA、DMA等，洗脱溶剂中的甲醇含量提高，有利于目标物被洗脱。且9.0 m L体积分数为10%的甲醇水溶液能基本洗脱完全目标物，所有的物质回收率在95.3%～98.7%。因而，采用9.0 m L体积分数为10%的甲醇溶液作为洗脱液。

2.2 仪器条件的选择

根据实验发现，氢气（H2）作为As检测的碰撞气具有更好的效果，选择H2作为其截取锥面碰撞气，优化出碰撞气流速为70 m L/min。同时，由于再加氮气作为辅助气可以提高As的等离子化效率，引入氮气（N2）作为辅助气，优化出流速为140 m L/m in。

据汉密尔顿色谱柱的应用说明报道，以硝酸铵作为流动相，PRP-X 100阴离子交换色谱柱对砷的形态分离具有分离效果，考虑到溶液配制的方便性，尝试用硝酸铵作为流动相来洗脱目标物，经过优化后，0.2μg/L的5种形态砷的分离高效液湘质谱图结果见图1。

图1 五种砷标样高效液相色谱图Fig.1 HPLC of mixed standards of five arsenic species

由图1可知，在上述仪器条件下5种形态的砷能在较短时间内得到比较好的分离。

2.3 质谱分析条件的优化

联机前使用布鲁克·道尔顿公司提供的调谐液铍（Be）、镁（Mg）、钴（Co）、铟（In）、钡（Ba）、铈（Ce）、铊（Tl）、铅（Pb）、钍（Th）（质量浓度1.0 μg/L）对ICP-MS进行调谐，以保证仪器的最佳状态和仪器状态的稳定性。砷的电离能较高，难以电离，采用高电离能1 400 W，保证各种砷形态的完全解离，同时调节采样深度、载气流速以及炬管位置，提高检测灵敏度同时降低氧形态和双电荷的比率，满足氧形态产率为氧化铈/铈（CeO/Ce）＜1.5%，双电荷产率铈2+/铈（Ce2+/Ce+）＜2.0%。

在测定黄酒中的砷+75（As+75）时，样品中的氯35（Cl35）容易与氩40（Ar40）或钙40（Ca40）形成氯化氩+75（ArCl+75）或氯化钙+75（CaCl+75）干扰检测，因此需要利用仪器具备的锥面碰撞技术加入碰撞气以消除多原子离子如A rCl+75和CaCl+75对As+75的干扰。实验前调节ICP-MS参数以获得最优信噪比（S/N），并保证基线的稳定性。

2.4 线性关系、测定低限、添加回收率及精密度

2.4.1 线性关系

配制质量浓度为0.5μg/L、1.0μg/L、2.0μg/L、10.0 μg/L、20.0 μg/L的5种砷形态的混合标准溶液，上机检测。以各形态峰面积（Y）为纵坐标，相应各种形态砷的质量浓度（X）为横坐标，绘制标准曲线，得出回归方程，并将0.5μg/L的混标溶液逐级稀释，以3倍信噪比为检出限，10倍信噪比为定量限，结果如表2所示。

表2 砷形态线性关系及检出限Table 2 Linear range and detection limit of As

由表2可知，在0.5～20.0 μg/L范围内，5种砷形态标准曲线线性良好，相关系数均＞0.999。5种砷形态的定量限均为0.10 μg/L，检出限均为0.03 μg/L。

2.4.2 回收率及精密度试验

在实验室内再现性条件下对添加标准溶液黄酒样品进行测定，验证方法的准确性和精密度，结果见表3。由表3可知，在3个加标质量浓度下回收率在85.2%～94.6%，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）1.4%～5.2%，检测结果表明该方法的准确性和精密度良好。

表3 黄酒样品回收率及精密度试验结果Table 3 Standard addition recovery rates and precision of Chinese rice wine

2.4.3 方法的验证

不同的实验室对加标2.5 μg/L、5.0 μg/L、10.0 μg/L含有基质的样品，按照本研究所采用的方法对回收率和稳定性进行了验证，结果如表4所示。

表4 方法验证结果Table 4 Verification results of the method

由表4可知，检测结果的室间RSD均在0.5%～4.5%，说明该方法是可行的。

2.5 实际样品的检测

选取砷总量含量较高的黄酒酒样，对不同的酒样中的砷形态及含量进行了测定并确定了各形态的含量。结果如表5～表7所示。表7同厂家不同品种的酒中各类砷的检测结果

表5 不同厂家不同年份不同类型酒中各类砷的检测结果Table 5 Detection results of arsenic in different types of the winesfrom different companies in different years μg/L

表6 同年份不同厂家酒中各类砷的检测结果Table 6 Detection results of arsenic in the wines from different companies in the same year μg/L

Table 7 Detection results of arsenic in different types of the wines from the same company μg/L

由表5～表7可知，在不同年份、不同类型、不同企业的酒中均含有砷酸根和一甲基砷，另外的形态不同的酒略有差异，但多数存在亚砷酸根和甜菜碱。极个别的酒含有二甲基砷。无机砷的含量之和几乎全部＞10 μg/L，这比国标GB 5749—2006《生活饮用水卫生标准》[15]总砷的限量还高，应该引起有关部门重视。这些元素的来源将是下一步的研究方向。

3 结论

黄酒经炭黑氨基柱净化，体积分数为10%甲醇水溶液洗脱，采用Hamilton PRP-XIO0阴离子交换色谱柱（4.1 mm× 250 mm，10 μm），60 mmol/L硝酸铵梯度洗脱，高效液相色谱分离，电感耦合等离子体质谱进行定性和定量分析。在0.5～20.0 μg/L范围内各砷形态线性良好，相关系数R均＞0.999；加标回收率为85.2%～94.6%，相对标准偏差（RSD）为1.4%～5.2%；5种砷形态的定量限均为0.10 μg/L，检出限均为0.03 μg/L。利用该方法对不同年份、不同企业及不同类型的黄酒进行了检测，明确了基酒和成品酒中砷存在的形态及其含量。有助于消费者选择性的采购和监管部门采取相应的措施。

参考文献：

[1]何瑶，黄清辉，刘颖，等.砷形态分析方法及其样品预处理技术研究进展[J].净水技术，2009，28（3）：10-13，44.

[2]熊文明，冯敏玲，李拥军，等.超声辅助提取-高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法测定南美白对虾中砷形态[J].广东农业科学，2013，874（12）：122-124.

[3]倪张林，汤富彬，屈明华，等.高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用技术测定花茶中砷形态[J].分析科学学报，2013，29（4）：506-509.

[4]李林林，朱英存.离子色谱-电感耦合等离子体质谱联用（IC-ICP-MS）测定水体中的砷形态[J].生态毒理学报，2013，8（2）：280-284.

[5]周萍，黄文耀.六种形态砷在不同消化方式下的转化行为研究[J].中国卫生检验杂志，2013，23（9）：2081-2084.

[6]王欣，幸苑娜，陈泽勇，等.高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法检测富硒食品中6种硒形态[J].分析化学，2013，41（11）：1669-1674.

[7]刘德晔，谷静，刘华良.离子色谱-电感耦合等离子体质谱联用研究尿中碘和钼形态[J].分析实验室，2013，32（7）：40-44.

[8]刘志江，金文英，党明岩，等.气相色谱-质谱联用技术在砷、硒、汞和铅形态分析中的应用[J].冶金分析，2011，31（6）：34-42.

四川工商学院作为四川地区首批本科“教育部ICT产教融合创新基地“项目建设高校之一，在教育部的指导下，依托大型企业—中兴通讯的设备，建成ICT创新基地，并借力中兴通讯委托的教育企业—北京华晟的人力、知识、技术、管理资源，校企共建了中兴通信学院，形成具有开放性、集成性、创新性的育人平台，有着其独特的办学特色和学生管理模式，通过与企业合作，成功地将SMART睿智职业规划体系运用于学生职前教育，把将企业元素与学生管理进行融合创新，让学生提前了解职场，认识职场，体验职场，让学生获得一种对社会和职场的认知。为此，我们做出了一系列探索和实践，解决了学生适应社会的难题。

[9]李博斌，刘兴泉，吴坚，等.黄酒中糖和无机元素成分与黄酒口味品质的定量关系研究[J].中国酿造，2010（8）：37-39.

[10]程和勇，徐子刚，黄旭，等.电感耦合等离子体质谱测定不同酒类中铬、砷、镉、汞、铅含量[J].浙江大学学报：理学版，2011，36（6）：679-682.

[11]兰玉倩，薛洁，江伟，等.黄酒陈酿过程中主要成分的变化研究[J].中国酿造，2011，30（5）：170-175.

[12]汪建国，沈玉根，陆伟杰.我国黄酒研究现状与发展趋势[J].中国酿造，2012，31（11）：20-25.

[13]MCSHEEHY S，NASH M.高效液相色谱与电感耦合等离子体质谱联用测定矿泉水中的三价铬与六价铬[J].环境化学，2009，28（4）：618-620.

[14]林凯，姜杰，黎雪慧，等.高效液相-原子荧光光谱法（HPLC-AFS）测定大米中不同形态砷方法的研究[J].实用预防医学，2013，20（1）：98-100.

[15]金银龙，鄂学礼，陈昌杰，等.GB 5749—2006生活饮用水卫生标准[S].北京：中国标准出版社，2006.

《中国酿造》杂志征稿启事

本刊主要面向全国各大高等院校、科研院所、各级党政机关、相关企事业单位的广大专家学者、工程技术人员、本科生、硕士博士研究生、管理人员等。

《中国酿造》主要栏目有：研究报告、专论综述、创新与借鉴、经验交流、分析与检测、产品开发、酿造文化、海外文摘等。

欢迎踊跃投稿！

网站：www.chinabrewing.net.cn邮箱：zgnzzz@163.com电话：010-83152738/83152308

征稿范围：

（1）新工艺、新技术、新设备在酿造行业的应用；（2）调味品的研发创新与推广应用；（3）调味品产业生产管理及产品质量安全评价；（4）食品添加剂在酿造行业的应用；（5）现代高新检测技术在酿造行业的应用；（6）酿酒产品开发、生产管理及产品质量安全的控制；（7）发酵法制备酒精、氨基酸、高级醇及有机酸等工艺研究；（8）微生物发酵工艺及培养基发酵条件优化；（9）发酵工程菌种的筛育与人工诱变、杂交选育及基因工程改造研究；（10）生物质能源的开发利用及规模化制备；（11）传统发酵食品生产工艺改进、微生物菌种改良、发酵机理及规模化生产研究；（12）食品及发酵工业废水、废渣处理及综合利用；（13）益生菌及功能型发酵乳制品研究与开发；（14）行业实用技术、政策、法规、标准及行业动态和最新举措等。

注意事项：

（1）来稿要求论点明确、数据可靠、逻辑严密、文字精炼。在文稿首页用脚注说明论文属何项目、何基金（编号）资助，本刊将优先报道国家级、省部级及国际合作项目的科研成果；第一作者及通讯作者（一般为导师）简介（包括姓名、出生年月、性别、职称、学位、研究方向或目前主要从事的工作、邮箱、联系电话）。（2）稿件要求8000字以内，须有中图分类号，文献标志码，中英文标题、单位、作者，并有200～300字的中英文摘要和5～8个关键词，标题、摘要、表题、图题请用中英文对照。摘要内容应包括研究目的、方法、结果和结论；综述文章可写指示性摘要。（3）来稿内容涉及配方时，应写明配料的名称和配比，勿用代号；工艺过程要完整，不要省略；插图、表格需放在正文相应地方，不要集中；引用的图表要有出处，计量要用法定单位。（4）文稿参考文献一般研究论文约25篇参考文献，不可少于20篇，综述论文不少于35篇。研究性论文和综述性论文中近5年文献不少于参考文献总数的一半，外文文献不少于5篇，期格式请参照GT/T 7714—2005《文后参考文献著录规则》。（5）来稿必须是最新的、作者自身创造性的科研成果，且是在中外文正式刊物上未发表的论文。本刊严禁一稿多投、重复内容多次投稿、不同文种重复投稿。（6）我刊以实现对所有来稿的文字复制比对工作，若文字复制比超过30%的稿件我刊不予采用。（7）稿件一经录用，即被认为同意收录于《中国学术期刊（光盘版）》、万方数据库等，同意入编数据库及上网发布，与此有关的作者著作权使用费与稿酬一次性给付。作者如有异议，请在投稿时声明。

Simultaneous analysis of arsenic speciations and contents in rice wine by HPLC-ICP-MS

SONG Weihua1,HU Beizhen1,HAN Chao2,DONG Wenhong1
(1.Comprehensive Technologic Service Center of Shaoxing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Shaoxing 312000,China; 2.Inspection and Quarantine Center,Wenzhou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Wenzhou 325000,China)

An analytical method for simultaneous determination of five arsenic speciations(arsenous acid radical,arsenate,arsenobetaine,MMAA, DMAA)in Chinese rice wine was developed by HPLC-ICP-MS.Samples were purified by carbon black amino column,10%methanol aqueous solution elution.The HPLC separation was performed on Hamilton PRP-XI00 negative ion analytical column(4.1 mm×250 mm,10 μm)utilizing a gradient elution program of 60 mmol/L ammonium nitrate as the mobile phase.Identification and quantification were achieved by ICP-MS.In the range of 0.5-20.0 μg/L,good linearity of 5 arsenic speciations was observed with correlation coefficients above 0.999.The adding standard recovery ranged from 85%to 92%with the relative standard deviations of 1.4%-5.2%.The quantification limits of five arsenic speciations were 0.10 μg/L,and the detection limits were 0.03 μg/L.The proposed method was applied to the simultaneous determination of five arsenic speciations in different types of Chinese rice wine from different years and different companies,and results showed that the method was suitable for arsenic residues determination in Chinese rice wine.

HPLC;ICP-MS;arsenic speciations;Chinese rice wine

O657

A

0254-5071（2015）03-0145-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.03.035

2015-01-15

浙江省公益性技术应用研究（分析测试）项目（2013C37095）

宋伟华（1982-），女，工程师，硕士，主要从事食品工业品检测工作。