冠突散囊菌液体培养条件的正交优化

冠突散囊菌液体培养条件的正交优化

郭劲霞， 邹自征*， 刘 蓉， 欧阳方丹， 文 敏

(益阳医学高等专科学校，湖南益阳 413002)

摘要[目的]研究冠突散囊菌(Eurotium cristatum)液体培养条件。[方法] 采用L16(45)正交试验设计，对影响冠突散囊菌生长的主要因素，包括黑茶浓度、蔗糖浓度、pH、培养温度和接种量进行5因素4水平筛选分析。[结果] 冠突散囊菌最优的液体培养条件为：黑茶浓度为0.7%，蔗糖浓度为5%，pH为5，培养温度为29 ℃，接种量为1%(孢子浓度为6.0×108cfu/ml)。[结论]该研究可为现代发酵工程技术应用于茯砖茶生产提供科学依据。

关键词冠突散囊菌(Eurotium cristatum);茯砖茶;正交设计;体系优化

中图分类号S571.1

作者简介郭劲霞(1970- )，女，湖南益阳人，副教授，从事生化营养研究。*

收稿日期2015-07-22

Optimization of Liquid Culture Conditions ofEurotiumcristatumUsing Orthogonal Design

GUO Jin-xia, ZOU Zi-zheng*, LIU Rong et al (Yiyang Medical School, Yiyang, Hunan 413002)

Abstract[Objective] To study the liquid culture conditions of Eurotium cristatum.[Method] Using L16(45) orthogonal design to analyze the main factors that affect the growing of Eurotium cristatum, including the concentration of black tea, sugar concentration, pH, temperature and inoculation quantity level.[Result] The best culture conditions were 0.7% black tea juice, 5% glucose, pH 5, culture temperature 29 ℃, inoculation quantity 1% (the concentration of spore was 6.0×108 cfu/ml).[Conclusion] The study provides scientific basis for applying the modern fermentation technology in the production of Fuzhuan tea.

Key wordsEurotiumcristatum; Fuzhuan tea; Orthogonal design; System optimization

黑茶是我国的特有茶类，经过长时间的渥堆发酵，茶叶色泽转化为黑褐色或黑色，故称黑茶[1]。我国西北地区干燥缺水，居民以肉食、乳酪为主食，缺少蔬菜、水果，黑茶具有消滞、减肥、止渴的作用，又便于携带与保存[2]，因此，黑茶成为了边疆牧民的“生命之饮”。

冠突散囊菌(Eurotiumcristatum)，属于散囊菌目发菌科散囊菌属，呈金黄色，俗称“金花菌”，是茯砖茶在特定温、湿度条件下，通过“发花”工艺长成的自然益生菌体[3]。冠突散囊菌与茯砖茶独特品质和各种保健作用的形成具有十分重要的联系。“金花”菌吸收茶叶中营养成分，经生物酶的催化生产诸多对人体有益的成分，包括酶和小分子代谢产物，具有促消化、降血脂、调节人体免疫功能等作用[4-5]，因此“金花”菌生长越旺盛，茶叶品质则越好[5-8]。此外，有研究表明，冠突散囊菌丝体富含15种氨基酸，其中包括所有的人体必需氨基酸[5,8]。

冠突散囊菌的培养主要集中在固体培养基上，液体培养少有报道，笔者采用正交设计的方法对冠突散囊菌液体培养体系进行优化，为黑茶制作工艺的改良提供理论基础。

1材料与方法

1.1材料茯砖茶：由湖南益阳茶厂提供；冠突散囊菌：益阳医学高等专科学校实验室保存。

1.2试验方法

1.2.1黑茶浸提液的制备 。参考邓放明的方法[9]配制1.0%的黑茶提取液备用。

1.2.2冠突散囊菌孢子悬液制备。实验室保存的冠突散囊菌复苏，复壮，用接种环将菌刮下，置于无菌水中，Vortex混匀(约10 min)，制备成浓度为6.0×108cfu/ml菌株悬液。

1.2.3影响冠突散囊菌生长因子的正交设计。采用L16(45)正交试验设计，对影响冠突散囊菌生长的主要因素，包括黑茶浓度、蔗糖浓度、pH、培养温度和接种量进行5因素4水平筛选分析，共16个处理，每个处理3次重复(表1)。500 ml三角瓶(每瓶装培养液200 ml)置于旋转式摇床，培养96 h，测定菌丝干重。

表1　冠突散囊菌培养的因素水平L 16(4 4)正交试验设计

1.3数据统计与分析数据分析采用The SAS System for Windows 8.0进行方差分析。

2结果与分析

利用统计软件SAS 8.0对统计结果进行方差分析，结果见表2。

2.1试验重复性检测该试验独立重复3次，从表2可以看出，第1、2和3次的重复的均值分别为0.269、0.267和0.267，无统计学差异，表明该试验重复性好。

2.2黑茶用量对冠突散囊菌生长的影响试验结果表明(图1)，黑茶浓度增加有利于冠突散囊菌生长。黑茶用量在0.7%以下，其差异显著(P<0.05)，黑茶用量在0.7%以上，菌丝干重变化不显著。因此，考虑到成本问题，黑茶最佳浓度为0.7%。

表2　各因素、水平对冠突散囊菌生长的影响

注：同一行不同字母表示在0.05水平上差异显著。

注：图中不同小写字母表示在0.05水平差异显著。 图1　黑茶浓度对菌丝干重的影响

2.3蔗糖浓度对冠突散囊菌生长的影响试验结果表明(图2)，蔗糖浓度对冠突散囊菌生长呈现一种类似倒钟型曲线关系。蔗糖浓度在5%以下，随蔗糖用量增加，菌丝干重增加；蔗糖浓度为5%时，菌丝干重最高2.93 g/L;蔗糖浓度超过7%时，菌丝干重下降显著。可能是随着蔗糖浓度增加，培养基渗透压也相应增大，对冠突散囊菌生长有一定抑制作用。因此，考虑到成本问题，蔗糖最佳浓度为5%。

注：图中不同小写字母表示在0.05水平差异显著。 图2蔗糖浓度对菌丝干重的影响

2.4发酵液初始pH对冠突散囊菌生长的影响与图2的结果类似，pH对冠突散囊菌的生长同样呈现倒钟型曲线，其最适pH为5(图3)。pH能影响到蛋白质的空间结构，从而影响菌内酶活性，过酸过碱，酶活性都会降低，这点试验结果与理论完全吻合。

注：图中不同小写字母表示在0.05水平差异显著。 图3　pH对菌丝干重的影响

2.5温度对冠突散囊菌生长的影响试验结果表明(图4)，温度对冠突散囊菌生长具有双重效应，在29 ℃以下时，增加温度，菌丝干重也显著增加(P<0.05)；一旦超过29 ℃，增加温度，菌丝干重迅速降低。可能的原因是温度直接影响到冠突散囊菌酶活性。因此，冠突散囊菌的最适温度为29 ℃。

注：图中不同小写字母表示在0.05水平差异显著。 图4　温度对菌丝干重的影响

2.6接种量对冠突散囊菌生长的影响从图5可以看出，1.0%的接种量菌丝干重最高，1.5%与2.0%接种量之间差异不显著，且与1.0%的结果差异显著(P<0.05)，0.5%的接种量菌丝干重最低，可能高浓度菌丝接种量可能会导致真菌产生相互抑制。最后确定最佳接种浓度为1.0%。

注：图中不同小写字母表示在0.05水平差异显著。 图5　接种量对菌丝干重的影响

综上所述，正交分析结果，液体培养体系中，其最优条件：黑茶浓度为0.7%，蔗糖浓度为5%，pH为5，培养温度为29 ℃，接种量为1%(孢子浓度为6.0×108cfu/ml)。

2.7最优结果的确认根据最优结果对冠突散囊菌进行培养，重复3次，菌丝干重均值为3.674 g/L，高于正交试验的每次处理值，达到了优化的目的。

3结论与讨论

微生物液体发酵技术的概念是20世纪40年代由美国弗吉尼亚大学生物工程专家Elmer L，Gaden.Jr提出，并设计出培养微生物系统的生物反应器，H.Humfeld、 S.Block博士、J.Szuess等人相继改进并成熟。该项技术具有原料来源广、成本低、生产周期短、工业化生产、无季节性等特点，适合自然条件下难以培养的珍稀菌种。

微生物液体发酵的过程复杂，受到很多因素的影响，找出关键因素，并将其优化，是工程技术人员首要解决的问题。

该研究采用多因素正交试验方法，对影响冠突散囊菌液体发酵的主要因素进行了研究，确定了冠突散囊菌液体发酵的最佳液体培养基和培养条件，液体培养体系中，其最优条件：黑茶浓度为0.7%，蔗糖浓度为5%，pH为5，培养温度为29 ℃，接种量为1%(孢子浓度为6.0×108cfu/ml)。该培养体系的建立，为冠突散囊菌的培养以及黑茶的研究奠定了技术和理论基础。

参考文献

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[6] 曹聪，刘素纯，达海韬，等.不同原料及生长因子对冠突散囊菌固体培养特性的影响[J].安徽农业科学,2010,38(17):9178-9179.

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[9] 邓放明.茯砖茶中冠突散囊菌分离培养及其发酵液胞外多糖与应用酶学研究[D].长沙：湖南农业大学,2007.