动态浊度法测定醒脑静注射液中间产品细菌内毒素的含量

刘薇薇甘国峰

（1 江南大学药学院，江苏 无锡 214122；2 无锡济民可信山禾药业股份有限公司，江苏 无锡 214028）

动态浊度法测定醒脑静注射液中间产品细菌内毒素的含量

刘薇薇1甘国峰2

（1 江南大学药学院，江苏 无锡 214122；2 无锡济民可信山禾药业股份有限公司，江苏 无锡 214028）

目的建立醒脑静注射液中间产品细菌内毒素定量测定方法，以进行生产过程质量监控。方法采用动态浊度法，分别对醒脑静注射液中间产品进行测定。结果醒脑静一次蒸馏液及灌封样品采用此法检测时，无干扰；而二次蒸馏液采用此法检测时，出现部分干扰。结论动态浊度法可用于醒脑静一次蒸馏液及灌封样品的细菌内毒素测定。

醒脑静注射液；中间产品；动态浊度法；细菌内毒素

醒脑静注射液是由麝香、冰片、郁金、栀子提取制成的注射剂，用于治疗脑栓塞、脑出血急性期、颅脑外伤、急性酒精中毒病症[1]，其工艺过程主要包括一次蒸馏、二次蒸馏、配液、灌封、灭菌等过程。

中药注射剂安全性再评价要求，生产工艺过程中应对中间产品的热原（或细菌内毒素）污染情况进行研究，并根据情况设置监控点。醒脑静注射液成品质量标准热原检测为家兔法，由于其操作繁琐费时，不适用于注射剂生产过程中的质量监控。近年来，一些学者已进行该品种细菌内毒素测定法代替家兔热原检测的研究，测定方法多为凝胶色谱法[2-7]，而凝胶法仅为限度检查或半定量法[8]。为更好的控制产品质量，本文研究采用动态浊度法对3种中间产品细菌内毒素的含量进行定量测定，并探讨该方法运用于生产的可行性。

1 材 料

1.1 试剂：细菌内毒素工作标准品（中国药品生物制品检定所，批号150601-201174，160 EU/支），细菌内毒素检查用水（BET水，中国药品生物制品检定所，批号w2010-8，10毫升/支），动态浊度法鲎试剂（湛江安度斯生物有限公司，批号1202022，1.25毫升/支，检测范围0.03～10 EU/mL）

1.2 检测样品：醒脑静一次蒸馏液（批号120616-Q1，120617-Q1， 120618-Q1），醒脑静二次蒸馏液（批号120616-Q2，120617-Q2，120618-Q2），醒脑静灌封样品（批号120616-Q3，120617-Q3，120618-Q3）。以上样品均由无锡济民可信山禾药业股份有限公司提供。

1.3 仪器：VersaMaxTM酶标仪（美国分子仪器公司），QL-901涡旋振荡器（江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司）。

2 方法与结果

2.1 细菌内毒素限值（L）：根据药品细菌内毒素限值的计算公式，L＝K/M；本品为注射剂，其K=5 EU/（kg·h）；本品每日最大用量20 mL，其M=0.3333 mL/（kg·h）；根据公式计算，醒脑静注射液细菌内毒素限值为15 EU/mL。

热原的检测剂量为2 mL/kg，细菌内毒素限值为2.5 EU/mL，为更严格的控制细菌内毒素，故将限值定为2.5 EU/mL。

2.2 标准曲线的可靠性试验：将细菌内毒素工作标准品用BET水稀释成每1 mL含0.03、0.15、0.75、3.75 EU细菌内毒素系列溶液。另取动态浊度法鲎试剂若干支，每支加入BET水，使其溶解。取0.1 mL细菌内毒素系列溶液分别加到预先加有0.1 mL动态浊度法鲎试剂的96孔无热原酶标板内，混匀，立刻置VersaMaxTM酶标仪进行自动检测，其中每一浓度重复3孔，并同时做阴性样品3孔。

表2 醒脑静3种中间产品干扰试验结果及细菌内毒素测定结果

其回归方程为：lgT=2.79-0.424lgC，相关系数 =0.990，其中C为细菌内毒素浓度（EU/mL），T为平均反应时间（s）；最低细菌内毒素浓度λ=0.03 EU/mL，空白对照在规定检测时间外，故细菌内毒素标准曲线成立。具体结果见表1。

表1 标准曲线可靠性试验结果

2.3 干扰试验

2.3.1 供试品最大有效稀释倍数（MVD）的计算：按MVD=L· C/λ1计算。L为醒脑静注射液细菌内毒素限值2.5 EU/mL，C为1.0 mL/mL，λ1为标准曲线的最低细菌内毒素浓度0.03 EU/mL，计算MVD为83倍。中间产品的最大有效稀释倍数同成品一致，最大稀释倍数为83倍。

2.3.2 供试品干扰试验：将中间产品用细菌内毒素检查用水依次稀释为10、20、40、60、80倍溶液，作为供试品溶液；同时另取试管，进行同样倍数稀释，但其中需添加中点浓度（λm=0.75 EU/mL）的细菌内毒素对照品溶液，作为含标准细菌内毒素供试品溶液。分别取上述各液0.1 mL加到预先加有0.1 mL动态浊度法鲎试剂的96孔无热原酶标板内，混匀，立刻置VersaMaxTM酶标仪进行自动检测，其中每一浓度重复2孔。按标准曲线线性回归方程，计算供试品溶液及含标准细菌内毒素供试品溶液的细菌内毒素含量C1和Cs，再按下式计算该试验条件下的回收率（R）。

R＝（Cs－C1）/λm×100%

3种中间产品干扰试验结果显示，见表2，醒脑静一次蒸馏液与醒脑静灌封样品在不同的稀释倍数下，其细菌内毒素回收率在50%～200%，认为在此试验条件下供试品溶液不存在干扰；且可在较低稀释倍数下，进行日常检测。醒脑静二次蒸馏液细菌内毒素回收率数据不稳定，120617-Q2在稀释10倍～40倍时存在干扰，其他批次在此稀释倍数下无干扰。

2.3.3 供试品细菌内毒素含量测定：按照干扰试验结果确定的稀释倍数进行检查，测定方法同干扰试验。由标准曲线线性回归方程计算每个样品的细菌内毒素浓度，单位为EU/mL。

3种中间产品细菌内毒素测定结果显示，见表2，其细菌内毒素测定值均符合标准要求，即值＜2.5 EU/mL，与凝胶法测定结果一致。

3 讨 论

醒脑静一次蒸馏液及灌封样品可采用低稀释倍数进行细菌内毒素控制。

从数据上看，不同批次的一次蒸馏液的细菌内毒值均符合标准要求，但仍存在一定差异。其中一次蒸馏液120618-Q1是120616-Q1值的2倍。此结果提示生产过程中，与药液接触的工器具需清洁到位。

醒脑静二次蒸馏液120617-Q2在稀释10倍～40倍时存在干扰，其原因可能为该蒸馏液为芳香水，非均质溶液，每批药液存在一定差异。因此进行日常检测时，可采用稀释60～80倍后进行测定，同时需结合凝胶法综合检测分析。

[1]国家食品药品监督管理局.国家药品标准WS3-B-3353-98-2003[S].2003.

[2]匡翠莲,王璐,张红宇.醒脑静注射液细菌内毒素检查法研究[J].中医临床研究,2012,4(2):114-117

[3]叶树林,王晓蕾.鲎试剂检查醒脑静注射液细菌内毒素的探讨[J].军医进修学院学报,2011,32(5):469-470

[4]王新明,张斌.醒脑静注射液内毒素检查法的可行性探讨[J].现代医药卫生,2003,19(1):114

[5]吴丽燕,张伽瑜.醒脑静注射液中细菌内毒素检查法探讨[J].新疆医学,2001,31(3):231-232

[6]王梅娟,谢斌.醒脑静注射液细菌内毒素检测方法的建立[J]. 中国医药导报,2008,5(34):12-13

[7]钱桂英.醒脑静注射液细菌内毒素检测方法的研究[J].现代医药卫生,2005,21(4):483-484

[8]国家药典委员会.中国药典2010年版(二部)[M].北京:中国医药科技出版社,2010:99-102.

Detection of Bacterial Endotoxin for Intermediates of Xingnaojing Injection by Kinetic Turbidimetric Assay

LIU Wei-wei1, GAN Guo-feng2
(1 School of Pharmaceutics, Jiangnan University, Wuxi 214122, China; 2 Wuxi Jiminkexin Shanhe Pharmaceutical Co. Ltd., Wuxi 214028, China)

ObjectiveTo establish the quantitative determination method of bacterial endotoxin in intermediates of Xingnaojing injection.MethodsIntermediates of Xingnaojing injection were detected by kinetic turbidimetric assay.ResultsThere was no interference during the detection process of the first distilled liquid and the filled and sealed samples. On the other hand, there was less interferences of the second distilled liquid.ConclusionThe method of kinetic turbidimetric assay is feasible to perform the bacterial endotoxin on the first distilled liquid and the filled and sealed samples of Xingnaojing injection.

Xingnaojing injection; Intermediates; Kinetic turbidimetric assay; Bacterial sendotoxin

R927.12

B

1671-8194（2015）08-0042-02