固相萃取结合GC-O/MS分析威代尔冰葡萄酒中的香气活性化合物*

马玥，唐柯，徐岩，李记明，，于英，李兰晓

1(工业生物技术教育部重点实验室，江南大学生物工程学院酿酒微生物与酶技术研究室，江苏无锡，214122)

2(烟台张裕葡萄酿酒股份有限公司，山东烟台，264000)

冰葡萄酒(icewine)又被称作冰酒，是以自然结冰的葡萄为原料，采用特殊酿造工艺酿成的一种甜型葡萄酒［1-2］，酸甜平衡，香气浓郁，呈现出蜂蜜、桃子、焦糖、杏等香气特征［3-4］，其独特的风味受到消费者的喜爱。

葡萄酒的风味在很大程度上取决于葡萄酒中的香气成分，葡萄酒香气也是葡萄酒品质中重要的评价指标。目前对冰酒的香气研究主要集中在对不同国家、地域及不同葡萄品种的感官评价及挥发性成分的检测上。加拿大及德国是主要的冰酒生产国，其中加拿大冰酒具有水果及花香味，而德国冰酒则具有明显的坚果香［4-5］。在冰葡萄酒中已检测到360余种挥发性成分，其中主要包括酯类、醇类、酸类、醛酮类、萜烯类、硫化物、呋喃类、内酯类及芳香族化合物［6］。每一类甚至每一种化合物对于葡萄酒香气贡献都不相同，在这些化合物中，目前仅发现几十种化合物对冰酒香气有重要贡献，其在不同的冰酒中也具有不同的表现［3］。目前我国冰酒的香气研究则主要集中在挥发性化合物检测上。王玉峰等采用溶剂萃取法在赤霞珠冰葡萄酒中获得了38种挥发性成分，其中，乙酸乙酯、2-羟基丙酸乙酯、3-甲基丁醇、苯乙醇、2，3-丁二醇等含量较高［7］。李艳霞等采用固相微萃取技术，在威代尔冰酒中定性到59种挥发性成分［1］。王蓓等采用搅拌棒吸附萃取了威代尔冰酒中的挥发性成分，定性得到108种挥发性化合物［8］。

由于不同化合物的阈值不同，高含量的化合物其感官贡献并不一定高，有些低阈值化合物在仪器上也无法检测到。采用气相色谱-闻香法(GC-O)结合气相色谱质谱法(GC-MS)分析样品中风味化合物可以用于寻找对样品香气贡献较高的化合物。GC-O分析中常用到时间强度法、稀释分析法与频次法，又以稀释分析法中的AEDA(aroma extraction dilution analysis)最为常见［9］。辽宁桓仁是中国重要的冰酒产区，所生产的威代尔冰酒具有怡人的香气，但是其重要香气成分仍不明确，因此探究形成冰酒感官特性的主要化合物并找出它们对于酒感官特性的贡献对于冰酒的品质控制有重要意义。本研究以同一年份不同等级的威代尔冰酒为研究对象，采用固相萃取法(SPE)对香气进行富集，在极性与非极性柱上通过GC-O结合GC-MS分析，来确定威代尔冰酒中重要的香气成分，为指导冰酒的酿造及品质控制提供理论依据及支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

2010年产威代尔冰葡萄酒(烟台张裕葡萄酿酒股份有限公司)，包括黑钻、蓝钻、黄钻3个不同等级。甲醇(上海安谱，色谱纯)，乙醇(上海安谱，色谱纯)，二氯甲烷(上海安谱，色谱纯)，Na2SO4(上海国药集团，分析纯)，NaCl(上海国药集团，分析纯)，C5-C30烷烃标样(天津光复精细化工研究所，色谱纯)。

1.2 仪器与设备

Gerstel ODP2闻香装置，德国 Gerstel公司;气相色谱质谱联用仪GC 6890N-MSD 5975，美国Agilent公司;萃取固相小柱为LiChrolut EN(0.5 g填料)，Merck公司。

1.3 实验方法

1.3.1 固相萃取方法

固相萃取柱润洗活化后，以1 mL/min的速率上样，样品体积为60 mL。样品吸附结束后，用20 mL超纯水洗去柱子上可能残存的糖、色素等小分子极性化合物，用10 mL二氯甲烷洗脱柱上吸附的香气化合物。用氮气将萃取有机相浓缩至250 μL，进行GC-O及GC-MS分析。

1.3.2 分析条件

GC-O分析:AEDA法。冰酒香气萃取样品用二氯甲烷按1∶2比例等比稀释，通过GC-O在色谱柱上分析样品，直到无法嗅辨到香气化合物。每种物质的稀释因子值为无法感知到该种香气的最高稀释度。每种样品由2名经过半年以上闻香培训的闻香员进行嗅辨分析，每个样品的每个稀释度进样3次。3次中出现2次以上则保留该稀释因子数值。香气化合物通过使用DB-FFAP及HP-5MS两种色谱柱来定性。

极性色谱柱为DB-FFAP(60 m×0.25 mm i.d.×0.25 μm，美国Agilent公司)。柱温采用程序升温，初温50℃保持2 min，以6℃/min速率升温至230℃并保持15 min;进样口温度为250℃;不分流进样，进样量 1μL;载气为氦气，流速 2mL/min。［0］

非极性色谱柱为HP-5MS(30 m×0.25 mm i.d.×0.25 μm，美国 Agilent公司)。柱温采用程序升温，初温50℃保持2 min，以5℃/min速率升温至240℃并保持15 min;进样口温度为250℃;不分流进样，进样量 1μL;载气为氦气，流速 2mL/min。［0］

质谱条件:电子轰击(EI)离子源;电子能量70 eV;离子源温度230℃;质量扫描范围m/z 35～500。

1.3.3 定性方法

香气活性成分的定性通过与NIST 05质谱库(Agilent Technologies Inc.)中标准谱图匹配、与文献报道的保留指数比对、香气化合物香气特征及标准品来确定。保留指数根据改进的Kovats法计算得到，在待测酒样中加入C5-C30烷烃的混标，进GC-MS分离，通过烷烃的保留时间来计算未知化合物的RI。

2 结果与分析

2.1 GC-O嗅辨分析及GC-MS定性分析结果

利用SPE将不同等级的3种冰酒进行香气浓缩，通过GC-O嗅辨分析及GC-MS定性分析共获得65种对冰酒香气有一定贡献的化合物，结果如表1所示。3种同年份冰酒的极性柱总离子流色谱图如图1～图3所示。其中检测到酯类13种、醇类13种、萜烯类11种、芳香族化合物4种、酚类4种、内酯3种、酸类3种、硫化物3种、呋喃酮2种、醛酮类1种及未知化合物8种。

图1 黑钻级冰酒挥发性成分极性柱GC-MS总离子流色谱图Fig.1 GC-MS total ion chromatogram of volatile components of Vidal icewine(Black)separated by polar column

图2 蓝钻级冰酒挥发性成分极性柱GC-MS总离子流色谱图Fig.2 GC-MS total ion chromatogram of volatile components of Vidal icewine(Blue)separated by polar column

图3 黄钻级冰酒挥发性成分极性柱GC-MS总离子流色谱图Fig.3 GC-MS total ion chromatogram of volatile components of Vidal icewine(Yellow)separated by polar column

由表1可以发现，同一年份3种等级的威代尔冰酒在闻香获得的香气化合物的种类上有一定差别，但最重要的香气化合物(至少在一种酒中，其稀释因子在81以上)基本相同，只是在其香气强度上有一定差异，说明不同等级冰酒主要香气成分构成上具有一致性，同时酿造工艺又对冰酒的香气轮廓产生一定影响，也构成了不同等级冰酒所特有的香气特征。这些重要的香气化合物主要为酯类、醇类、萜烯类、硫化物及呋喃酮类化合物，包括异丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、异戊醇、2-庚醇、1-庚醇、顺式-玫瑰醚、3-甲硫基丙醛、脱氢芳樟醇、β-大马酮、菠萝酮及3种未知香气化合物。

表1 威代尔冰酒香气化合物AEDA闻香结果Table 1 Important aroma compounds in Vidal icewine detected by GC-O/MS

2.2 不同活性香气化合物分析

2.2.1 酯类

酯类化合物是发酵类饮品中重要的香气化合物，由醇及酸通过酯化反应产生。在葡萄酒中，酯类化合物可分为通过酶促反应产生的及在低pH环境下贮藏过程产生的两类［10］。

续表1

3种不同等级的冰酒中共闻到13种酯类化合物，其主要表现为水果香。其中乙酸乙酯(苹果)、异丁酸乙酯(菠萝)、丁酸乙酯(甜瓜)、己酸乙酯(果皮)及辛酸乙酯(荔枝)在3种酒中稀释因子不低于9。其中异丁酸乙酯在黑钻级冰酒中稀释因子可达243。这几种酯类除了己酸乙酯外，其他几种在Bowen等人对加拿大威代尔冰酒的重要香气研究中没有闻到［3］，这可能是由于地域性差异造成的。2-甲基丁酸乙酯，在三等级酒中皆有检测到，但是在黄钻级酒中香气强度较弱，稀释因子仅为1，而在黑钻级酒中稀释因子为243，该化合物有苹果类香气。

2.2.2 醇类

醇类化合物是酒中重要的风味化合物，醇类化合物是酒精发酵、氨基酸转化及亚麻酸降解物氧化的主要产物。3种不同等级的冰酒中共闻到13种醇类化合物，其主要表现为植物清香。其中异戊醇、己醇、2-庚醇及1-庚醇对冰酒的香气贡献较为明显，其稀释因子不低于9，特别是异戊醇，在醇类化合物中对冰酒的香气贡献最大，其稀释因子在3种酒中皆高于243，表现为类似指甲油一样的清香。异戊醇在葡萄酒中的含量很高，其在冰酒中含量超过10 mg/L［5］。己醇表现为松子或坚果味，2-庚醇表现为蘑菇味，1-庚醇具有一种类似烘烤或油脂的味。

2.2.3 萜烯类

萜烯类化合物是葡萄酒中微量成分，具有较低的阈值，对葡萄酒的香气贡献较大。萜烯化合物的种类及含量与葡萄品种，土壤，气候及葡萄栽培有很大关系［11］。

3种不同等级的冰酒中共闻到11种萜烯类化合物。在11种萜烯类化合物中，对香气贡献最大的是顺式-玫瑰醚、β-大马酮及脱氢芳樟醇，这3种香气在3种酒中的稀释因子皆高于27。顺式-玫瑰醚表现为荔枝或玫瑰香，在黄钻级的酒中稀释因子最高，为81。β-大马酮是威代尔冰酒中重要的香气化合物，具有近似蜂蜜的甜香味，在3种级别的酒中稀释因子皆不低于243，在黑钻及蓝钻级别的酒中，其稀释因子可达729。β-大马酮在食品及葡萄酒香气成分分析中已被广泛报道，其具有极低的觉察阈值，仅为0.05 μg/L。顺式-玫瑰醚及β-大马酮皆具有怡人的甜香，在Bowen等人对加拿大威代尔冰酒的研究中同样也发现其是重要的香气化合物［3］。

2.2.4 硫化物

3个等级的威代尔葡萄酒中共闻到3种硫化合物，无法通过质谱检测到，是由极性与非极性的保留指数定性及独特的香气特征匹配得到的，推测其为4-巯基-4-甲基-2-戊酮、2-甲基-3-呋喃硫醇及 3-甲硫基丙醛。其中贡献最大的是3-甲硫基丙醛，表现为煮土豆味，在3种酒中的稀释因子皆为81。4-巯基-4-甲基-2-戊酮的香气特征是典型的黑醋栗芽孢味，2-甲基-3-呋喃硫醇则表现出一种坚果的香气特征。

2.2.5 呋喃及内酯类

呋喃是食品中重要的风味化合物，在葡萄酒香气的研究中，呋喃类化合物也被广泛地报道，呋喃类化合物在食品中的形成途径可分为3种，包括碳水化合物的热解，美拉德反应及焦糖化反应［12］。内酯类化合物一般由对应的羟基酸在一定的条件下环化而成，4-烷基丁内酯(γ-lactones)及 5-烷基戊内酯(δ-lactones)是酒中常见的内酯类化合物，对香气有积极贡献［13］。

菠萝酮(furaneol)，酱油酮(homofuraneol)是葡萄酒中2种重要的呋喃酮类香气化合物，在红葡萄酒、白葡萄酒及贵腐酒中皆有检出，在贵腐酒中最高稀释因子分别可达625及3 125［14-16］。在本研究中，菠萝酮和酱油酮其香气表现为焦糖类的甜香，菠萝酮的稀释因子最高为243，酱油酮的稀释因子最高为27。美拉德反应是一种还原糖与氨基酸在一定的水分条件下发生的羰氨反应。在冰酒体系中，其糖含量很高，并且主要以还原糖为主，而总氨基酸含量也在1g/L以上［17］。因此，美拉德反应可能是造成冰酒中这两种呋喃酮类化合物高香气强度的原因。

研究仅通过MS定性获得了3种内酯化合物，分别是γ-癸内酯、δ-癸内酯及桃醛，桃醛也称丙位十一内酯。这3种内酯的香气特征比较相似，皆表现为桃子或杏干。这3种内酯化合物在3种酒中，除了桃醛在蓝钻级的酒中的稀释因子为27，其稀释因子皆不高于9，但是这3种内酯可能是冰酒中杏桃味的重要来源。

2.2.6 其他类

除了酯类、醇类、萜烯类、硫化物、呋喃酮类及内酯类化合物，威代尔冰酒中还有芳香类、酚类、酸类及醛酮类化合物，也对其香气存在一定贡献。

威代尔冰酒中重要的芳香族化合物有苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、2-(4-甲基苯基)丙-2-醇、苯乙醇，其分别表现苹果、花香、汽油及花香。曾有研究认为苯乙醇是威代尔冰酒的特征香气［2］，但是从本结果来看，其稀释因子不高于27，对冰酒的香气贡献并不显著。

在3种不同等级的冰酒中还闻到4种酚类化合物。酚类化合物大多由橡木带来，如橡木桶，橡木片甚至橡木塞。本研究中对冰酒香气有一定贡献的有愈创木酚及4-乙烯基愈创木酚，其表现为烟熏烟草类的刺激味，其在三等级的冰酒中稀释因子均不低于3。实验中仅闻到癸醛这一种醛酮类化合物对冰酒香气存在贡献，其表现为坚果味。酸是酒中重要的组成部分，其在酒的挥发性化合物含量中也占有较高比例，但是由于酸的觉察阈值也较高，其对冰酒的香气贡献只起到辅助作用。本研究结果显示对冰酒香气有贡献的酸包括乙酸、辛酸及癸酸，3种酸中只有辛酸在3个等级的冰酒中皆有闻到，这3种酸的稀释因子皆不高于3。

此外在3种不同等级的冰酒中还闻到8种未知化合物，其中7.24 min出现的奶油味，8.72 min出现的蓝莓味及25.29 min出现的蜂蜜味具有较高的稀释因子，在冰酒中较为重要。

3 结论

本实验采用SPE结合GC-O及GC-MS分析，通过化合物在极性柱与非极性柱上的闻香结果，保留指数计算及质谱库匹配来确定威代尔冰酒中的重要香气化合物。实验共检测到65种对冰酒香气有一定贡献的化合物，包括酯类13种、醇类13种、萜烯类11种、芳香族化合物4种、酚类4种、内酯3种、酸类3种、硫化物3种、呋喃酮2种、醛酮类1种及未知化合物8种。其中酯类、醇类、萜烯类、硫化物、呋喃酮类及内酯类是威代尔冰酒中重要的香气物质，主要表现为水果味，植物清香，花香，烘焙类香气及甜香。在所有已知的香气化合物中，异丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、异戊醇、2-庚醇、1-庚醇、顺式-玫瑰醚、3-甲硫基丙醛、脱氢芳樟醇、β-大马酮及菠萝酮对冰酒的香气贡献较大，其至少在一个级别的酒中最高稀释因子不低于81。这几种重要的香气化合物在3个等级的冰酒中均能检测到，但其香气强度存在一定差异，表明酿造工艺可对冰酒的香气轮廓产生一定影响。

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