人乳腺癌裸鼠移植模型建立体会

周文斌，周冬仙，陈亦欣，彭树松，邙建波(深圳市人民医院＆暨南大学第二临床医学院乳腺甲状腺外科，深圳 5800;深圳市人民医院＆暨南大学第二临床医学院肿瘤研究所;深圳市人民医院＆暨南大学第二临床医学院病理科;通讯作者，E-mail:5449958@qq．com)

乳腺癌是一种严重危害妇女健康的恶性肿瘤，其发病率在世界范围内呈上升趋势，对其基础与临床研究与日俱增，以进一步认识其生物学行为并发展新的治疗方法。乳腺癌实验动物模型是研究乳腺癌生物学行为及进行药物实验治疗的重要工具之一，目前报道的多为乳腺癌自发模型或诱发模型［1－3］。由于上述2个方法存在一定局限性，本研究探讨建立人乳腺癌细胞移植模型。

1 材料与方法

1．1 材料

实验动物:裸小鼠(BALB/C－nu/nu)20只，购于中山大学实验动物中心，雌性，6周龄，重量16－20 g，饲养于层流罩中。乳腺癌细胞系:雌激素受体(estrogen receptor，ER)阳性的MCF-7细胞系由中山大学附属第一医院普外科提供。培养基为250 ml的RPMI1640，含10%小牛血清和4 U胰岛素，pH为7．4;在5%CO2、37 ℃孵育箱中培养;用0．25%胰蛋白酶(Sigma公司，美国)消化传代。

1．2 方法

人源性乳腺癌细胞MCF-7培养于DMEM(Gibco公司，美国)培养液中，常规加10%FBS、100 μg/ml青霉素、100 U/ml链霉素、0．2 U/ml胰岛素、0．1 nmol/L雌激素。放置5%CO2、37℃孵育箱中培养。

培养的MCF-7细胞经胰酶消化后，用Hank液清洗2次，再用1%锥虫蓝染色，在细胞计数板上作细胞计数，并调节使活细胞浓度为1×107/ml，于裸鼠右下腹壁接种0．1 ml/只。裸鼠继续饲养于层流罩中。

1．3 结果观察及统计

肿瘤细胞接种后，每天观察裸鼠生命体征、饲料及饮水情况、肿瘤生长情况，每周测量肿块的大小，计算公式:表面积=(长/2+宽/2)×π，并对裸鼠瘤体拍照。裸鼠死亡后切除肿块、测定肿块的长径和重量，对肿块进行乳腺癌病理类型和雌激素受体免疫组化等病理学检查。

2 结果

2．1 肿瘤生长情况

MCF-7乳腺癌细胞接种后6 d，在左下腹接种部位处出现肿瘤结节，质地较硬，肿块随着时间推移逐渐增大。我们每周测量肿块大小，提示肿块日渐增大(见表1)。第20－30天肿瘤生长较快，第26天开始，裸小鼠出现死亡现象，至第45天时死亡8只，死亡率 40．0%(8/20)。

表1 裸鼠肿瘤表面积(±s)Table 1 Changes of tumor surface of nude mice after incubation(±s)

表1 裸鼠肿瘤表面积(±s)Table 1 Changes of tumor surface of nude mice after incubation(±s)

时间(d) 肿瘤表面积(mm)3．96 ±1．88 14 5．01 ±2．05 21 7．97 ±2．35 28 10．00 ±2．12 7 35 12．98 ±2．20

在第45天，处死幸存12只荷瘤裸鼠，完整剥离肿块，分别测量每一瘤体的最长径和瘤体质量，具体见表2。计算所有肿瘤的平均直径和质量分别为(11．08 ±1．38)mm 和(0．996 ±0．097)g。移植瘤瘤体表面皮肤完整，无缺损(见图1)。

2．2 病理学检查

肉眼观移植瘤呈圆形或椭圆形，与周围组织及腹壁肌肉等轻度粘连，未侵犯皮肤。肿块质地中等，剖面呈灰白色(见图2)。光镜下见:癌组织内间质少，实质多，癌细胞排列成团;癌细胞大，胞质丰富，核大，核仁清晰，多型性明显。病理诊断为浸润性导管癌，免疫组化染色提示ER阳性表达。

表2 存活裸鼠瘤体长径和质量Table 2 Tumor size and weight of survived nude mice

图1 移植瘤皮肤外观Figure 1 Skin appearance of transplanted tumor

图2 移植瘤瘤体外观Figure 2 Appearance of transplanted tumor

3 讨论

乳腺癌是一个世界范围内的严重危害妇女健康的恶性肿瘤，在我国其发病率不断上升，部分地区已跃居女性恶性肿瘤的第一位。单纯依靠改进手术技巧很难提高手术切除率，化疗、放疗和内分泌等的治疗效果也都有一定的局限性，而且副作用较大，乳腺癌总体治愈率近10年来没有得到显著提高。目前临床治疗效果略有改观的主要原因是由于早期发现、早期诊断、早期治疗，而不是治疗方法本身的进步［4，5］。治疗失败的主要原因是肿瘤的复发和转移。因此，人们一直在努力探索新的有效治疗方法［4，5］。在对乳腺癌生物学行为的认识和发展新的治疗方法上，乳腺癌动物模型是其中一项基础性工作，起着非常重要的作用。

目前报道的乳腺癌模型，多为乳腺癌的自发模型、诱发模型或转移模型。自发性的通常比用实验方法诱导的肿瘤与人类所患的肿瘤更为相似，但肿瘤发生情况可能参差不齐，模型很难在短时间内获得大量的肿瘤学材料;诱发性乳腺癌模型操作简单，但诱癌过程需要较长的时间。研究乳腺癌的治疗，移植模型更能直观地反映疗效［6－8］。本研究的目的是建立人乳腺癌细胞移植模型，为研究内皮抑素的抗血管和淋巴管生成治疗提供可靠的研究工具。

本研究所选用的动物为裸鼠(nude mice)，它是一种因基因突变造成的先天性细胞免疫缺陷动物。裸鼠无毛、无胸腺，缺乏成熟的T淋巴细胞，接受人类及其他异种不发生排斥，肿瘤移植后生长良好，并能保持肿瘤细胞的原有形态及病理特性，是肿瘤研究中较为理想和常用的动物［3］。MCF-7细胞株是人源性乳腺癌细胞株，国内外研究也多采用此种瘤细胞系。

多数学者常将MCF-7乳腺癌细胞株接种于裸鼠的乳垫部位［7］，个别也将MCF-7乳腺癌细胞株接种于裸鼠腋窝皮下［9］。本课题组发现，接种于裸鼠的乳垫部位，可能乳垫部位皮肤比较敏感，由于瘤体生长的刺激，裸鼠的前肢体更容易抓伤接种部位皮肤而造成瘤体及表面皮肤溃烂;而接种于腋窝皮下，裸鼠的固定和操作略微复杂。因而我们改为将MCF-7乳腺癌细胞株接种于裸鼠右下腹壁皮下部位，裸鼠取平卧体位，操作简单。本研究证明:MCF-7乳腺癌细胞株在裸鼠右下腹壁部位生长良好，瘤体表面皮肤完整。笔者认为，如果我们建立人乳腺癌裸鼠移植动物模型不是研究与乳腺癌区域淋巴结转移的相关性课题，而主要是用于肿瘤生物学行为研究和疗效评估等，将MCF-7乳腺癌细胞株接种于裸鼠右下腹壁皮下部位是可行的。

本组结果显示，肿瘤细胞移植后，荷瘤裸鼠在层流罩中存活、生长良好，移植瘤成功率高，达100%。肿瘤生长情况易于观察，肿块切除后病理检查确定为浸润性导管癌，免疫组化检测ER受体阳性。移植的肿瘤细胞保持了人类乳腺癌肿瘤细胞的病理学特征，为基础研究、临床治疗和疗判断提供了可靠工具。

本实验的失败之处是实验动物裸小鼠容易出现死亡。我们每天观察裸鼠3次，下午观察时裸鼠并没有明显不适表现，可是第2天上午去查看时却出现死亡裸鼠，我们与实验动物中心专家研讨，没有找到明确原因和解决办法。初步考虑如下几种可能:①疾病因素。由于我们没有对死亡裸鼠进行尸体解剖，目前尚不能证实。②饲料污染。我们购买的是包装好的经过辐射灭菌的饲料，符合饲养标准。③荷瘤对裸鼠的影响。目前尚无实验证据支持，下一步，我们将建立对照组，以了解荷瘤对裸鼠生存时间的影响。研究如何降低裸鼠死亡率是动物实验过程中需要探讨的一个重要课题。

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