人纤溶酶原丝氨酸蛋白酶(SP)活性区基因的克隆、表达与功能研究

崔 佳，万翠香(长治医学院微生物学教研室，长治 046000;南昌大学食品科学与技术国家重点实验室;通讯作者，E-mail:cuixiangwan@ncu．edu．cn)

人纤溶酶原(plasminogen，Plg)是由810个氨基酸多肽构成的糖蛋白，分子量约92 kD，成熟的Plg包括N端多肽NTP，5个同源的三角区(K1－K5)及丝氨酸蛋白酶(SP)区。在碱性条件(pH 11．0)下，纤溶酶限制性降解纤溶酶原Arg530-Lys531位上的肽键，特异性降解出由261个氨基酸残基构成的SP区，即微小纤溶酶原(microplasminogen，μplg)，它完全保留了纤溶酶原的丝氨酸蛋白酶(SP)活性区，并可被纤溶酶原激活剂激活后形成微小纤溶酶，具有纤溶活性［1－3］。

Plg的大多数抑制剂是丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族(serpin superfamily)的成员［3］，包括 α2－ 抗纤溶酶(α2-AP)、PA抑制物(PAI)，它们分别调控纤溶酶plasmin和Plg激活剂PA。

2006年，瑞士雀巢研究中心预测并报道了长双歧杆菌NCC2705中一类具有丝氨酸蛋白酶抑制剂活性的外膜蛋白Serpin的存在，推测了Serpin的作用可能是抵抗外源蛋白酶的消化，并为双歧杆菌在宿主肠道内的定植提供一个极其重要而有利的竞争条件［4］。本实验室在前期的研究工作中已成功从长双歧杆菌中分离到Serpin外膜蛋白，使之在原核表达体系中大量表达，并且得到了高纯度的Serpin蛋白。最新文献报道，人Plg可与双歧杆菌一些表面蛋白黏附［5］，然而未有关于Plg与Serpin表面蛋白相互作用的报道，依据Plg结构中有丝氨酸蛋白酶结构域，我们推测Plg也能与双歧杆菌的Serpin表面蛋白相互作用，并且实验加以验证。

1 材料与方法

1．1 菌株与质粒

菌株:E．coli．DH5α、BL21(DE3)来源于南昌大学食品科学与技术国家重点实验室。质粒:pDNR-plg购自于德国Thermo公司、pET22b(+)、T载体购自于TaKaRa公司。

1．2 主要试剂与仪器

EcoRⅠ 和HindⅢ 内切酶购自于TaKaRa公司;双歧杆菌Serpin重组蛋白为南昌大学食品科学与技术国家重点实验室保存;磁性纳米粒子购自于无锡中德伯尔生物技术有限公司。Ni+-NTA树脂:Merk公司;PCR仪:Eppendorf公司;离心机:德国Thermo公司;凝胶成像系统:Bio-Rad公司。

1．3 pDNR-plg质粒提取，μplg基因克隆

上游引物:5'－G GAATTC CTGGAAGGGTTGTAGGG－3'(EcoRⅠ);下游引物:5'－CCC AAGCTT CTCAATCCAAGTAACAAACC－3'(HindⅢ)。

使用2×μpfu Mix通过PCR从pDNR-plg中扩增到目的片段μplg基因，然后加Poly A尾连接至pMD18-T克隆载体，转入E．coli DH5α，筛选阳性克隆子测序。测序正确的克隆子经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切得到目的片段，电泳检测后用DNA片段回收试剂盒进行目的片段回收，再与表达载体pET22b(+)连接构建重组表达载体pET22b(+)-μplg，挑取阳性重组子，双酶切及测序验证正确后，转入表达宿主E．coli BL21，备用。

1．4 μPlg蛋白的表达

将转化到大肠杆菌E．coli BL21获得的重组子单菌落接种至新鲜的2 ml LB/Amp培养基，培养至对数初期转接至150 ml LB/Amp培养基中，对数初期加入终浓度为0．2 mmol/L IPTG，37℃诱导表达3 h，离心洗涤收集菌体后，采用超声波破碎菌体，分离上清和沉淀，SDS-PAGE检测蛋白表达情况。同时参考文献［6］以携带 pET22b(+)的 E．coli BL21非重组子作为对照。

1．5 μPlg蛋白的复性与纯化

SDS-PAGE检测μPlg蛋白主要在沉淀中以包涵体形式存在，6 mol/L尿素溶解后进行包涵体蛋白复性，透析缓冲液选用20 mmol/L Tris-HCl，透析2－3 d，每4 h换液1次［7］，透析完成后进行SDS-PAGE检测透析效果。之后参照Ni+-NTA His·Bind树脂柱说明书对上清中的分泌型μPlg蛋白进行特异性纯化。

1．6 μPlg蛋白与双歧杆菌Serpin表面蛋白共孵育

参照文献［8］，μPlg蛋白与10 mg(10 mg/ml)磁性纳米粒子在室温反应3 h，4℃过夜，使其充分偶联，再与双歧杆菌的Serpin重组表面蛋白室温孵育2．5 h，SDS-PAGE电泳检测孵育结果。

2 结果

2．1 重组克隆载体pMD18-T-μplg的构建

重组质粒pMD18-T-μplg双酶切鉴定结果见图1所示，在680 bp左右EcoRⅠ和HindⅢ 双酶切产生1条与目的片段μplg大小相符的条带，且测序结果正确，表明目的片段μplg已成功连接入克隆载体pMD18-T。

图1 pMD18-T-μplg双酶切验证电泳图谱Figure 1 Electrophoresis of recombination plasmid pMD18-T-μplg after double enzyme digest

2．2 重组表达载体pET22b(+)-μplg的构建

电泳结果显示，选取的重组子质粒酶切结果均切出680 bp左右的条带(见图2)，表明目的基因片段μplg已经插入到表达载体 pET22b(+)中，送南京金斯瑞公司测序，测序结果正确。

图2 pET22b(+)-μplg双酶切验证电泳图谱Figure 2 Electrophoresisofrecombinantplasmid pET22b(+)-μplg digested by EcoRⅠand HindⅢ

2．3 μPlg蛋白的表达

μPlg蛋白的诱导表达结果见图3。pET22b(+)-μplg重组质粒的诱导表达带与空质粒pET22b(+)诱导带相比，在沉淀中35 kD附近出现一条显著的蛋白过量表达条带，与目的蛋白μPlg预计大小相符，而空质粒pET22b(+)未出现相应的目的条带。

图3 SDS-PAGE检测μPlg诱导表达结果Figure 3 Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis of the μPlg protein expression

2．4 μPlg蛋白的复性与纯化

将μPlg包涵体融合蛋白用6 mol/L尿素溶解进行复性，电泳结果显示大约有50%的包涵体蛋白经复性后是以可溶的形式存在于上清中。取复性上清中μPlg蛋白经Ni+-NTA His·Bind树脂柱纯化后用SDS-PAGE检测，电泳结果显示250 mmol/L咪唑可以洗下大多数结合目的蛋白，纯化的条带清晰且不含杂带，获得了高纯度的μPlg蛋白(见图4)。

图4 μPlg蛋白变性和纯化检测电泳图谱Figure 4 Electrophoresis of renaturation and purification of μPlg protein

2．5 μPlg蛋白与Serpin蛋白共孵育

将双歧杆菌Serpin外膜蛋白与磁珠偶联的μPlg共孵育，甘氨酸－盐酸洗脱后出现了一个新的条带，通过与Marker比较，该蛋白的分子量大约为70 kD(见图5)，推测其极有可能为Serpin与μPlg结合物。

图5 Serpin与μPlg蛋白共孵育后电泳图谱Figure 5 Electrophoresis of Serpin incubating with μPlg

3 讨论

Plg丰富存在于人体的血浆和细胞外液，其作为酶原转化为具有活性的plasmin，对于溶解纤维蛋白、降解胞外基质起重要作用。本实验对Plg 6个结构域中的丝氨酸蛋白酶结构域SP区即μplg进行了克隆表达，目的蛋白大部分在沉淀中以包涵体的形式存在，其原因可能为:Plg来源于真核生物，在大肠杆菌原核表达体系中不能够正确折叠，因此很难形成可溶性蛋白［9］。为此，选择蛋白质复性来获得可溶性μPlg蛋白，电泳显示，蛋白的复性率大约为50%。

由于Plg蛋白结构中含有丝氨酸蛋白酶的结构域SP区，且大多数Plg抑制剂是丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serpin)超家族的成员，因此推测μPlg很可能与Serpin发生特异性结合。近年来，双歧杆菌的外膜蛋白在黏附定植肠黏膜表面，阻止病原菌的入侵方面发挥着重要作用［10，11］，而 Serpin作为双歧杆菌一种重要外膜蛋白也陆续在很多菌种中发现［1，6，12，13］，并推测其在肠道的炎症部位可能减弱蛋白酶的效应进而起到保护菌体的作用，但是关于Serpin在肠道内参与双歧杆菌黏附定制的机制则研究甚少。本研究将纯化到的μPlg与实验室前期制得的Serpin通过磁珠法共孵育，结果得到了一个约70 kD蛋白复合物，初步推断二者可发生相互作用，这表明人类的Plg蛋白可能是双歧杆菌黏附的一个特异性受体。人体Plg在肠道微生物菌体的表面招募，赋予了菌体潜在的代谢能力，更加有利于菌体的定植［5，14，15］。

本实验所用到的磁珠法在研究配体和受体的作用、分离筛选生物活性物质等方面具有广泛的应用。磁性纳米粒子通过表面修饰提供足够多的结合位点与一种生物分子结合，进而去捕获、识别另一种相互作用的生物组分，然后在外加磁场的作用下快速实现富集、浓缩、纯化［16，17］。基于现在的研究，磁珠偶联配体寻找目的蛋白的方法对益生菌功能蛋白筛选具有方法学指导意义，今后还可以将此偶联有Plg蛋白的磁珠与其他活性物质相互连接，进一步探究人类纤溶酶原的生物学功能。

［1］Zhang L，Seiffert D，Fowler BJ，et al．Plasminogen has a broad extrahepatic distribution［J］．Thromb Haemost，2002，87(3):493－501．

［2］宋钢．人纤溶酶原结构和功能研究进展［J］．国外医学分子生物学分册，1999，27(1):39－42．

［3］Castellino FJ，Ploplis VA．Structure and function of the plasminogen/plasmin system［J］．Thromb Haemost，2005，93(4):647－654．

［4］Ivanov D，Emonet C，Foata F，et al．A Serpin from the gut bacterium Bifidobacterium longum inhibits eukaryotic elastase-like serine proteases［J］．J Biol Chem，2006，281(25):17246－172．

［5］Candela M，Bergmann S，Vici M，et al．Binding of human plasminogen to Bifidobacterium［J］．J Bacteriol，2007，189(16):5929－5936．

［6］崔佳，万翠香，杨友均，等．Serpin的多抗制备和产Serpin的双歧杆菌菌株的初步筛选［J］．食品与生物技术学报，2011，30(6):934－939．

［7］赵喜红，何小维，李文美，等．大肠杆菌表达包涵体蛋白体外复性研究进展［J］．食品工业科技，2010，31(6):379－383．

［8］徐锋，彭珍，万翠香，等．高特异性长双歧杆菌多克隆抗体的制备［J］．中国生物制品学杂志，2010，23(2):182－184．

［9］谢磊，孙建波，张世清，等．大肠杆菌表达系统及其研究进展［J］．华南热带农业大学学报，2004，10(2):16－20．

［10］Riedel CU，Foata F，Philippe D，et al．Anti-inflammatory effects of Bifidobacteria by inhibition of LPS-induced NF-kappaB activation［J］．World J Gastroenterol，2006，12(23):3729－3735．

［11］Preising J，Philippe D，Gleinser M，et al．Selection of Bifdobacteria based on adhesion and anti-Infammatory capacity in vitro for amelioration of murine colitis［J］．Appl Environ Microbiol，2010，76(9):3048－3051．

［12］Turroni F，Foroni E，Motherway MO，et al．Characterization of the serpin-encoding gene of Bifidobacterium breve 210B［J］．Appl Environ Microbiol，2010，76(10):3206－3219．

［13］叶若松，黎鹏，章昭琳，等．两歧双歧杆菌中serpin基因的克隆、表达与功能分析［J］．中国生物工程杂志，2011，32(2):38－42．

［14］Candela M，Miccoli G，Bergmann S，et al．Plasminogen-dependent proteolytic activity in Bifidobacterium lactis［J］．Microbiology，2008，154(Pt8):2457－2462．

［15］Candela M，Biagi E，Centanni M，et al．Bifidobacterial enolase，a cell surface receptor for human plasminogen involved in the interaction with the host［J］．Microbiology，2009，155(Pt10):3294－3303．

［16］Gu H，Ho PL，Tsang KW，et al．Using biofunctional magnetic nanoparticles to capture vancomycin-resistant Enterococci and other gram-positive bacteria at ultralow concentration［J］．J Am Chem Soc，2003，125(51):15702－15703．

［17］Gantelius J，Hartmann M，Schwen JM，et al．Magnetic bead-based detection of autoimmune responses using protein microarrays［J］．Nat Biotechnol，2009，26(6):269－ 276．