尿道致病性大肠杆菌黏附人尿路膀胱癌细胞的实验研究

谷 超，王海涛，周晓冬，侯 敏，李 光(天津医科大学基础医学院生物学教研室，天津 00070;天津市泌尿外科研究所肿瘤免疫室;天津市胸科医院检验科;通讯作者，E-mail:ydsweyou@6．com;共同通讯作者，E-mail:ydswlg@6．com)

尿路感染(urinary tract infections，UTIs)是人类感染性疾病的多发病。大肠杆菌是UTIs的主要致病菌，在引起下位尿路的尿道炎、膀胱炎后可上行性感染导致肾盂肾炎。其中引起肾盂肾炎的大肠杆菌80%以上具有P菌毛，称为尿道致病性大肠杆菌或致肾盂肾炎大肠杆菌(Uropathogenic E．coli，UPEC)［1，2］。UPEC的pap黏附基因簇编码的P菌毛介导与上皮细胞的黏附是形成感染的先决条件。同时UPEC菌株还含有编码其他与其致病性密切相关毒力因子的基因。研究尿路感染性细菌与宿主尿路上皮细胞相互作用需要建立敏感细胞感染模型。有关UPEC对尿路细胞黏附的报道较少，本研究在前期实验［3，4］的基础上进行了UPEC菌株感染人尿路移行上皮癌细胞的相关研究，为深入探讨尿路感染的致病机制奠定基础。

1 材料和方法

1．1 菌株

UPEC132，源自天津医科大学总医院的肾盂肾炎患者尿标本分离菌株，其基因型为papA F13+papGⅡ型［5］;UPECJ96 为 papA F13 型的代表株［5］;E．coli K-12p678-54为无菌毛代表株，均为Hull教授惠赠，上述菌株培养采用LB培养基。

1．2 UPEC毒力基因papC，hly和cnf1的PCR检测

以受试菌株染色体DNA为模板，采用PCR方法检测papC，复合PCR检测hly和cnf1。用于扩增papC的上游引物5'－GAC GGC TGT ACT GCA GGG TGT GGCG－3'和下游引物5'－ATA TCC TTT CTG CAG GGA TGC AATA－3'，扩增hly的上游引物5'－AAC AAG GAT AAG CAC TGT TCT GGCT－3'和下游引物5'－ACC ATA TAA GCG GTC ATT CCC GTCA－3'以及扩增cnf1的上游引物5'－AAG ATG GAG TTT CCT ATG CAG GAG－3'和下游引物5'－CAT TCA GAG TCC TGC CCT CAT TATT－3'，均由大连TaKaRa公司合成。反应体系(25 μl)为:10 × buffer缓冲液2．5 μl，dNTP 0．2 mmol/L，上下游引物各 0．4 μmol/L，模板 DNA 1 μl，TaqDNA 聚合酶(TaKaRa 公司)0．25 μl。反应条件为:95 ℃ 预变性5 min;95 ℃ 1 min，60 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，30个循环;最后72℃延伸7 min。试验中以UPECJ96为阳性对照，E．coli K-12p678-54为阴性对照，同时设空白对照。

1．3 人尿路膀胱癌细胞系EJ的传代培养

选取人EJ细胞系(由天津市泌尿外科研究所肿瘤免疫室提供)用于UPEC黏附尿路上皮性细胞的研究。EJ细胞的培养体系为含10%FBS的RPMI 1640培养液(Sigma公司)，添加青霉素(100 μg/ml)和链霉素(100 μg/ml)。EJ细胞于液氮罐中冻存，用前需进行细胞复苏，置入37℃，5%CO2孵箱中静置培养24 h，更换培养液。每日观察细胞生长情况，隔日换液1次，传代时加入消化液(0．25%胰蛋白酶∶0．02%EDTA 为1∶1)，随时用倒置相差显微镜观察并终止消化。传至2－3代的细胞铺满瓶底80%时制备细胞爬片，将传代细胞悬液接种于置有盖玻片的24孔板中常规培养。

1．4 UPEC的细胞黏附试验

当上述制备的单层细胞爬片细胞占玻片面积达60%时即可用于细菌黏附试验。用吸管弃掉旧培养液，经RPMI 1640培养液洗涤3次，加入未加双抗的含10%FBS的RPMI 1640培养液0．9 ml。分别将UPEC132和E．coli K-12p678-54的LB平板培养物制备成菌悬液(107CFU/ml)，每孔加入 0．1 ml，置37 ℃，CO2孵箱内，分别于 15，30，60，120，180 min取出，每个条件下设3个复孔。实验中还选用受试菌液体培养物离心后的上清部分代替上述菌悬液进行同样操作，同时设以PBS代替菌悬液同样操作的空白对照。于不同黏附时间取出盖玻片，用 DHank’s彻底冲洗3次，去除未黏附的细菌，自然干燥。甲醇固定15 min后Giemsa染色，用95%乙醇及无水乙醇脱水，中性树脂封片。显微镜下观察细胞形态的变化，高倍镜下5次随机选取100个细胞，计数有细菌黏附的细胞数及黏附的细菌总数，并用下述公式计算黏附率和黏附指数:黏附率(%)=(表面有细菌黏附的细胞数/100)×100%;黏附指数(细菌数/每个细胞)=黏附的细菌总数/100。

1．5 统计学分析

2 结果

2．1 UPEC毒力基因PCR结果

以受试菌的染色体DNA为模板，利用papC，hly和cnf1的特异性引物进行PCR和复合PCR扩增，产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，UPEC132和UPEC J96均获得大小分别为328 bp，1177 bp和498 bp的特异性片段(见图1)，表明UPEC132具有编码毒力因子P菌毛，溶血素(Hly)和细胞坏死因子(CNF1)的基因。

图1 不同菌株毒力基因papC，hly和cnf1的琼脂糖凝胶电泳Figure 1 Agarose gel electrophoresis of different virulence genes papC，hly and cnf1

2．2 UPEC对人尿路膀胱癌EJ细胞的黏附实验

分别将试验菌株UPEC132和 阴性对照菌株E．coli K-12p678-54作用于人膀胱癌EJ细胞，计算不同作用时间后的黏附率和黏附指数。结果显示，E．coli K-12p678-54的细胞黏附率和黏附指数均为0。UPEC132作用于EJ细胞在15－180 min内的黏附率为22．50%－76．30%，随着时间的延长黏附率逐渐增加，黏附指数于120 min达到高峰，为43．35±5．63，然后有所下降(见表1)。经统计学处理，作用30，60，120和180 min的黏附率和黏附指数之间无统计学差异(P＞0．05)，但均明显高于15 min的结果(P ＜0．01)。

表1 UPEC132对EJ细胞不同作用时间黏附能力的比较Table 1 Comparison of adhesive ability of UPEC132 to EJ cells at the different time points

图2 E．coli K-12p678-54菌株感染EJ细胞 (Giemsa，×200)Figure 2 EJ cells infected by E．coli K-12p678-54(Giemsa，×200)

光镜镜检结果显示，EJ细胞是一类人尿路移行上皮癌细胞，培养细胞呈上皮样，具有与上皮细胞相似的特征，但比人正常二倍体细胞的核质比例高，镜下可见胞内近中央处有较大且不规则形细胞核。阴性对照组E．coli K-12p678-54作用于人膀胱癌EJ细胞后其形态无变化(见图2)。而UPEC132作用于EJ细胞后，与阴性对照组相比其细胞形态发生明显变化(见图3)。黏附后细胞由扁平伸展圆缩为不规则形状，胞间连接变得更为松散，细胞间隙增大，Giemsa染色着色不均。油镜下可见，EJ细胞在感染UPEC132后，胞浆突呈圆形、减少或消失(见图4A)，部分细胞核内出现大量空泡样变(见图4B)。部分EJ细胞表面有大量细菌黏附，细胞边缘分布的细菌使胞膜沿菌体局部凹陷，胞质和胞核内出现包有菌体的空腔(见图4C)，部分EJ细胞的胞膜破损(见图4D)。值得注意的是，用UPEC132液体培养物离心后上清部分感染细胞并无形态学改变。?

图3 UPEC132菌株黏附 EJ细胞 (Giemsa，×200)Figure 3 EJ cells adhered by UPEC132(Giemsa，×200)

图4 EJ细胞被UPEC132菌株粘附后的形态学改变 (Giemsa，×2 000)Figure 4 Morphological changes of EJ cells adhered by UPEC132(Giemsa，×2 000)

3 讨论

尿路感染按解剖部位的不同分为尿道炎、膀胱炎和肾盂肾炎。其中肾盂肾炎较为严重，除尿道刺激症状外，还出现全身症状，而且常常由于用药不规则导致细菌极易产生多重耐药性，病情反复发作、迁延不愈，晚期出现肾功能不全，危及病人生命。一些慢性尿路炎症(如膀胱黏膜慢性炎症)还与尿路恶性肿瘤(如膀胱移行上皮细胞癌)的发生有关。尿路感染的发生大多由大肠杆菌引起。因此，对于尿道致病性大肠杆菌致病机制的深入研究不仅丰富微生物学的理论，而且为制定抗尿路感染治疗的策略提供新思路。

UPEC具有一系列菌株特异性毒力因子，常常由位于染色体上的致病岛基因编码。绝大多数UPEC菌株表达Ⅰ型菌毛和P菌毛，与该菌的宿主细胞黏附和内在化有关［6］。此外，细胞坏死因子(CNF1)可增强细胞受体的亲和力及细胞骨架肌动蛋白的聚合作用;溶血素(Hly)不仅作用于红细胞，还作用于肾上皮细胞、内皮细胞和免疫细胞等，具有形成细胞孔的活性和诱导细胞凋亡的作用［7］。经血凝试验、免疫电镜和papA的序列分析［5］表明UPEC132菌株编码 P菌毛，与UPEC J96同属 papA F13型，并具有CNF1和Hly毒力因子。该菌株可以特异性地黏附人肾盂上皮原代细胞，只有菌体直接黏附细胞后才会产生毒性作用，导致细胞形态的显著变化，对其变化的机制有待进一步的研究。

从细菌和宿主细胞相互作用的角度开展病原菌致病机制的研究中必然涉及到细胞感染的模型。曾有报道UPEC与Buffalo猴肾细胞及兔睾丸细胞的研究［8，9］，未见UPEC与人类尿路细胞感染模型的广泛应用。本研究首次成功选用了人膀胱癌EJ细胞进行UPEC细胞黏附的实验研究，结果显示UPEC对EJ细胞有较强的黏附性并对细胞骨架系统产生影响，使被感染细胞发生明显的形态学改变。EJ细胞虽然为癌细胞，但源于人尿路移行上皮细胞，比上述两类动物细胞更贴近人体内尿路上皮细胞的致病过程，并且可以与UPEC黏附尿路正常移行上皮细胞研究［2，3，10］进行对比，相关的深入研究仍在进行中。

［1］Jermy A．Bacterial pathogenesis:UPEC helps host to exfoliate［J］．Nat Rev Microbiol，2012，10(3):159．

［2］Asadi KM，Oloomi M，Habibi M，et al．Cloning of fimH and fliC and expression of the fusion protein FimH/FliC from Uropathogenic Escherichia coli(UPEC)isolated in Iran［J］．Iran J Microbiol，2012，4(2):55－62．

［3］Gu C，Chen JY，Hou M，et al．Adhesion of uropathogenic Escherichia coli to human renal pelvis epithelial primary cells［J］．Chin J Microbiol Immunol，2006，4(4):252－257．

［4］谷超，陈锦英，侯敏，等．致肾盂肾炎大肠杆菌对人肾盂上皮原代细胞黏附的实验研究［J］．中华微生物学和免疫学杂志，2007，27(9):802－806．

［5］陈锦英，康宁，李方涛．致肾盂肾炎大肠杆菌papA基因的克隆及序列分析［J］．中华微生物学和免疫学杂志，2000，20(3):189－192．

［6］Justice SS，Hung C，Theriot JA，et al．Differentiation and developmental pathways of uropathogeic Escherichia coli in urinary tract pathogenesis［J］．Proc Natl Acad Sci U S A．，2004，101(5):1333－1338．

［7］Schmidt H，Hensel M．Pathogenicity islands in bacterial pathogenesis［J］．Clin Microbiol Revs，2004，17(1):14－56．

［8］Vranes J．Hemagglutination ability and adherence to the Buffalo green monkey cell line of uropathogenic Escherichia coli［J］．APMIS，1997，105:831－837．

［9］Biswas B，Bhushan S，Rajesh A，et al．Uropathogenic Escherichia coli(UPEC)induced antimicrobial gene expression in the male reproductive tract of rat:evaluation of the potential of Defensin 21 to limit infection［J］．Andrology，2015，3(2):368－375．

［10］Shen XF，Ren LB，Teng Y，et al．Luteolin decreases the attachment，invasion and cytotoxicity of UPEC in bladder epithelial cells and inhibits UPEC biofilm formation［J］．Food Chem Toxicol，2014，72:204－211．