Ad-HGF转染LMC培养上清液对大鼠大脑动脉内皮细胞的作用

Ad-HGF转染LMC培养上清液对大鼠大脑动脉内皮细胞的作用

丁纪超刘旻张晓鑫李彤

(新乡医学院第一临床学院，河南新乡453000)

摘要〔〕目的探讨Ad-HGF转染大鼠脑膜间皮细胞(RMMCs)得到的细胞培养上清液促脑血管新生的分子调控及相关作用。方法无菌条件下取出生1～2 d SD大鼠的脑组织，采用机械吹打、轻消化法结合组织块培养法原代培养大鼠脑动脉内皮细胞，传3代后，通过倒置相差显微镜观察细胞形态，普通光学显微镜观察细胞HE染色、第Ⅷ因子相关抗原、细胞免疫荧光染色等三方面进行细胞鉴定；通过MTT法检测Ad-HGF感染LMC培养上清液对细胞增殖能力的影响；通过 Transwells法检测对细胞迁移能力的影响；通过免疫印迹(WB)法检测CAEC中TGF-β1蛋白表达情况。结果Transwells细胞迁移实验见PVPE膜上大量被结晶紫染色的CAEC；随机选取100倍视野下细胞迁移的数量进行比较，实验组与对照组有显著性差异(P<0.05)；MTT法发现，实验组与对照组也有显著性差异(P<0.05)；同一时间点，随着Ad-HGF感染LMC培养上清液及外源性HGF浓度增加，CAEC中TGF-β1平均光密度值逐渐降低，TGF-β1平均光密度值呈一定量相关性，差异有显著性(P<0.05)。结论采用机械吹打、胰酶消化法结合组织块培养法可以成功获取高纯度大鼠CAEC；Ad-HGF感染LMC培养上清液具有促进大鼠CAEC增殖和迁移的作用；Ad-HGF感染LMC培养上清液及HGF具有抑制CAEC中TGF-β1蛋白表达的作用。

关键词〔〕肝细胞生长因子；脑动脉内皮细胞；血管新生；基因治疗；神经保护

中图分类号〔〕R39〔文献标识码〕A〔

基金项目：河南省自然科学基金资助项目(112101310400)；河南省科技厅资助项目(082102310015)

通讯作者：李彤(1963-)，女，博士，硕士生导师，主要从事脑血管病研究。

第一作者：丁纪超(1986-)，男，在读硕士，主要从事脑血管疾病的综合治疗与基础研究。

大脑动脉内皮细胞(CAEC)是构成血脑屏障的主要成分，具有活跃的分泌、合成、代谢及免疫功能，可产生多种细胞因子和生物活性物质，参与调节机体的生理活动，是各种生理、病理因素的靶细胞。肝细胞生长因子(HGF)为一独立的促血管生成因子，具有神经营养、促轴突发生〔1〕、血管发生、减少胶质瘢痕合成〔2〕以及促进脑室管膜下区相关神经细胞的增殖、分化作用〔3〕。TGF-β1为调控血脑屏障完整性的重要因子，与HGF相互作用的效应因为细胞、细胞环境及细胞内主要活性因子不同而不同，尤其对神经胶质化的调控HGF-TGF-β1平衡具有重要作用。本课题前期实验结果显示，Ad-HGF可以显著减少治疗组大鼠脑组织TGF-β1的表达，随着HGF的表达量增加TGF-β1的表达下降，表明Ad-HGF可能通过抑制TGF-β1的表达促进血管新生，减少脑缺血引起的神经损伤。本实验期望为明确Ad-HGF感染LMC培养上清液对大鼠CAEC是否具有促血管新生作用提供实验基础。

1材料与方法

1.1主要试剂与仪器出生1～2 d健康Sprague-Dawley(SD)大鼠由新乡医学院实验动物中心提供Ad-HGF感染LMC培养上清液来自河南省神经病学研究所DMEM高糖培养基(Gibco)、胎牛血清(Hyclone)、胰蛋白酶(Gibco)、磷酸盐缓冲液(PBS)(武汉博士德)、D-Hank液(Gibco)、二甲基亚砜(DMSO)(Amersham)、台盼蓝(Sigma)、噻唑兰(MTT)、SERVAFITC标记的羊抗兔IgG(武汉博士德)、兔抗大鼠第Ⅷ因子相关抗原抗体(Rabbit Anti-factor Ⅷ)，(北京博奥森DAB显色试剂盒)、HGF(h)武汉博士德、ELISA kit(96T)(武汉博士德)、封闭用山羊血清(武汉博士德)，其余试剂均为市售国产分析纯试剂。

纯化水系统(Dlamond RO型)、Thermo Scientific超纯水器(NANOpure Dlamond型)、Thermo Scientific电子分析天平(TE612-L型)(Sartoulus)、超净工作台(SW-CJ-2FD型)(苏州安泰空气技术有限公司)、倒置相差显微镜(TS100-F型)(日本Nikon)、免疫荧光显微镜(ECLIPSE 55i型)(日本Nikon)、CO2细胞培养箱(371高温灭菌型)(Thermo Scientific)、超低温冰箱(Thermo Forma型)、全自动灭菌柜(HVE-50型)(Thermo Scientific)，日本Hiayama低温高速离心机(CL31R型)、Thermo Scientific低速离心机、北京广安医疗器械厂微量可调加样器(Thermo Forma型)、Thermo Scientific恒温干燥箱、(DHG-9140型)电热恒温水温箱、Thermo Scientific台式精密PH计(MODEL818型)、Thermo Orion Z-C恒温振荡器、酶标仪(MK3型)、Thermo Scientific细胞培养瓶、美国Coning细胞冻存管、Transwells细胞迁移板(美国Costar)。

1.2细胞培养及鉴定无菌条件下取出生1～2 d SD大鼠脑组织，采用机械吹打、轻消化法结合组织块培养法〔4〕原代培养大鼠脑动脉内皮细胞，传3代后，通过倒置相差显微镜观察细胞形态，普通光学显微镜观察细胞HE染色、第Ⅷ因子相关抗原、细胞免疫荧光染色等三方面进行细胞鉴定。

1.3HGF及Ad-HGF感染LMC上清液对CAEC细胞增殖的影响体积分数0.125%胰蛋白酶-EDTA消化CAEC细胞后，用含体积分数10%胎牛血清的DMEM重悬细胞，将细胞浓度调整为5×107/L。实验分3组：第一组为空白组，不添加HGF及Ad-HGF感染LMC上清液，取96孔板，每天在固定时间增设4个复孔，放入温箱中培养，每隔3 d换液一次。第2组为添加HGF组，取96孔板，每天在固定时间增设4个复孔，并加入等量100 ng/L浓度的HGF，放入温箱中培养，每隔3 d换液一次。第3组为Ad-HGF感染LMC上清液组，取96孔板，每天在固定时间增设4个复孔，并加入相同效应的Ad-HGF感染LMC上清液，放入温箱中培养，每隔3 d换液一次。7 d后，在同一时间取出96孔板，每组取4个孔均吸弃培养液后，每孔加MTT 20 μl(实验组、对照组每孔滴加MTT前用PBS轻轻冲洗2遍以减少误差)，放入37℃温箱孵育4 h，小心吸弃孔内MTT，每孔加入150 μl DMSO，震荡10 min使紫色结晶物甲瓒充分溶解，在酶联免疫检测仪选择570 nm波长测定各孔吸光度值。

1.4迁移实验取1块Transwell小室的24孔板，每3个小室为1组，分为实验组(加入Ad-HGF感染LMC上清液)和对照组(空白组)。将CAEC细胞用含胎牛血清蛋白(10 g/L)的DMEM培养基重悬，调整浓度为3×108/L。 每个小室加入100 μl的细胞悬液，在小室下方的孔内，每个孔加入600 μl含体积10%胎牛血清的DMEM培养液。小室内再加入HGF含量为100 ng/ml浓度的Ad-HGF感染LMC上清液1 ml，将6个小室置于温箱中孵育16 h后，每个小室及下室加入体积分数4%多聚甲醛共1 ml，固定细胞5 min，然后加入体积分数100%甲醛1 ml，在室温下通透细胞20 min，再加入姬姆萨染液1 ml，细胞染色15 min，吸弃姬姆萨染液并用PBS洗涤2遍，用棉签轻轻擦去聚碳酸酯膜上层细胞，光镜100倍下每孔按上、中、下、左、右摄取5张照片，计数并组迁移细胞数。

1.5免疫印迹(WB)实验随机设定不同浓度HGF组及Ad-HGF感染LMC培养上清液组，在同一时间点通过WB法检测CAEC中TGF-β1蛋白表达情况。体积分数0.125%胰蛋白酶-EDTA消化CAEC细胞后，用含体积分数20%胎牛血清的DMEM重悬细胞，将重悬的细胞按2∶5传代至5个培养皿中，为HGF组分别编号为a1、b1、c1、d1、e1。细胞浓度为1.7×105/ml，每皿细胞数为6.8×105/L，设定a1为空白对照组，其他各组加入外源性HGF浓度依次为10、20、40、80 ng/ml。同样方法设Ad-HGF感染LMC培养上清液组，分别编号为a2、b2、c2、d2、e2，a2为空白对照组，其他各组加入等效Ad-HGF感染LMC培养上清液。用含20%胎牛血清的培养液将每皿中的培养液体积调整为13 ml。置于37℃、体积分数5%CO2饱和湿度培养箱中培养72 h。取出10个CAEC细胞培养皿，PBS冲洗两遍，用RIPA细胞裂解液裂解细胞，提取总蛋白。用BCA法行总蛋白定量。采用5%浓缩胶和10%分离胶行聚丙烯酰胺凝胶电泳，浓缩胶电泳电压为80 V，分离胶电泳电压为100 V，电泳总时间约为2 h。将凝胶中的蛋白质转移至PVDF膜，PVDF膜位于阳极侧，凝胶位于阴极侧，采用150 mA电流，电转1.5 h。用5%的脱脂奶粉对转有蛋白条带的膜进行封闭1.5 h，洗膜后分别与1∶200兔抗鼠TGF-β1、1∶200兔抗鼠GAPDH抗体4℃孵育过夜，洗膜后加入1∶4 000羊抗兔IgG抗体室温孵育1 h。再次洗膜。转移至暗室中，将PVDF膜上的TBST液用吸水虑纸吸出，置于干净的培养皿中，取等量的超敏ECL化学发光即用型底物A液及B液混匀，将其滴加膜上，放入暗盒中曝光。用Quantity One软件分析，以相应蛋白条带的灰度值/GAPDH蛋白条带的灰度值表示相对蛋白含量。

2结果

2.1CAEC细胞形态及鉴定通过倒置相差显微镜观察大鼠脑动脉内皮细胞，培养48 h换液后，可见大量细胞从动脉血管段游出，呈短梭形或多角形。培养9 d，可见细胞铺满培养孔，形成典型的“铺路石”样外观，细胞大小、形状较为均一，融合度达80%以上，见图1。原代细胞培养9 d 后，细胞铺满瓶底行消化传代，经传代的第3代细胞用于鉴定，HE染色，细胞呈短梭形或多角形，大小不等，细胞质丰富，薄染为淡红色，着色均匀，见图2。在荧光倒置显微镜下观察，传代细胞核周围的胞质内均出现黄绿色荧光，即第Ⅷ因子抗原阳性(见图3)，阳性率达90%，胞质与胞核界限明显，而对照细胞不染色(阴性)。

图1　组织块培养法CAEC细胞形态结构(×100)

图2　CAEC细胞形态 (HE染色，×100)

图3　细胞间接免疫荧光染色法鉴定RMMCs(×200)

2.2MTT实验结果实验组与对照组相比差异显著(P<0.05)，见图4。

2.3Transwells细胞迁移实验见PVPE膜上大量被结晶紫染色的CAEC；随机选取100倍视野下细胞迁移的数量进行比较，实验组与对照组相比差异显著(P<0.001)，见图5。

2.4WB结果如图6，图7所示，同一时间点，随着Ad-HGF感染LMC培养上清液及外源性HGF浓度增加，CAEC中TGF-β1蛋白表达平均光密度值逐渐降低，随着时间增加，同一浓度的Ad-HGF感染LMC培养上清液及外源性HGF，CAEC中TGF-β1蛋白表达平均光密度值逐渐增加，TGF-β1平均光密度值呈一定量相关性，HGF组同一浓度不同时间点差异显著(P<0.001)，Ad-HGF感染LMC培养上清液组同一浓度不同时间点差异显著(P<0.001)，HGF组及Ad-HGF感染LMC培养上清液同一浓度相同时间点差异显著(P<0.001)。

图4　加入HGF及Ad-HGF感染LMC培养上清液 不同时间作用于CAEC后细胞活力变化

A为对照组，PVPE膜上很少见迁移出来的CAECs；B为实验组，PVPE膜上可见大量被结晶紫染色的迁移出来的CAECs 图5　Transwells细胞迁移实验(×100)

A：正常组;B～E：HGF 10、20、40、80 ng/L组 图6　HGF组不同时间点TGF-β1蛋白表达

A：正常组;B～E：Ad-HGF感染LMC培养上清液组，含HGF分别为10、20、40、80 ng/L 图7　Ad-HGF感染LmC培养上清液组TGF-β1蛋白表达

3讨论

本实验表明采用机械吹打、胰酶消化法结合组织块培养法可以成功获取高纯度大鼠脑动脉内皮细胞。Ad-HGF感染LMC培养上清液具有促进大鼠脑动脉内皮细胞增殖和迁移的作用。相比于HGF，Ad-HGF可以显著减少CAEC中TGF-β1蛋白表达，且随着Ad-HGF的浓度增加，TGF-β1蛋白表达下降，表明Ad-HGF感染LMC培养上清液可能通过表达HGF及其他增效因子间接抑制了TGF-β1的表达量，促进了CAEC的增殖。

HGF基因疗法对于缺血性脑血管病的基因转移载体包括腺病毒、脂质体、单纯疱疹病毒等。本实验课题选择E1、E3缺失的Ad-HGF，避免了野生型腺病毒的复制产生。前期实验针对腺病毒治疗的安全性问题我们进行了相关预实验，结果显示腺病毒载体仅在给药局部表达，持续2 w左右，使其在临床应用中更加安全。HGF基因转染能够增强细胞的增殖、迁移和血管生成能力，减少新内膜的形成，增加再内皮化，释放高浓度的可溶性HGF蛋白。Ad-HGF能够产生10倍于单纯贴壁单核细胞的HGF，与单独的细胞和基因治疗相比，基于细胞的HGF基因治疗是有效的治疗方法，能够减少细胞移植数量的要求，增强新生血管形成〔5〕。最近研究发现，HGF基因治疗可以促进低密度脂蛋白胆固醇经由P13GAkt信号通路对内皮细胞的损伤〔6〕。越来越多的证据表明，TGF-β1参与血管内皮细胞与周细胞的细胞间信号通讯，对血脑屏障的完整性具有重要作用。TGF-β1也是一多效能活性因子，参与调控细胞增殖、分化与凋亡，涉及胚胎发育及疾病发生等多种生物效应，其多效性因细胞不同而不同，并受细胞内主要活性因子影响。在周围血管形成的研究中发现主要为TGF-β1/ALKs/Smads(Smad 2/3/4)信号通路参与信号调控〔7〕。TGF-β1与HGF的相互作用依不同细胞、不同细胞环境具有相互促进与相互抑制双重效应，突出表现为HGF-TGF-β1平衡在组织损伤后的纤维化(胶质化)修复中具有明确的调控作用，HGF与TGF-β1相互平衡决定器官组织修复的结果〔8〕。 综上所述，HGF基因转染上清液相比较HGF能够增强细胞的增殖、迁移和血管生成能力，可能与多种细胞活性因子参与相关的信号调控有关系。

4参考文献

1Jeong SR，Kwon MJ，Lee HG，etal.Hepatocyte growth factor reduces astrocytic scar formation and promotes axonal growth beyond glial scars after spinal cord injury〔J〕.Exp Neurol，2012；233(1)：312-22.

2Li T，Zhang P，Yuan B，etal.Thrombin induced TGF-β1 pathway：a cause of communicating hydrocephalus post subarachnoid hemorrhage〔J〕.Int J Mol Med，2013；31(3)：660-6.

3Shang J，Defuchi K，Ohta Y，etal.Strong neurogenesis，angiogenesis，synaptogenesis，and antifibrosis of hepatocyte growth factor in rats brain after transient middle cerebral artery occlusion〔J〕.J Neruosci Res，2011；89(1)：86-95.

4吴秀芹，梅晓云，吴颢昕，等.大鼠脑微血管内皮细胞的原代培养与鉴定〔J〕.中国实验方剂学杂志，2011；17(3):398-400.

5Yamamoto M，Tanaka K，Maeda A，etal.Synergistic effects of autologous cell and hepatocyte growth factor gene therapy for neovascularization in a murine model of hindlimb ischemia〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2009；297(Suppl)：H1329-36.

6Yu XJ,Song MB,Chen JF,etal.Hepatocyte growth factor protects endothelial progenitor cell from damage of low-density lipoprotein cholesterol via the P13K/Akt signaling pathway〔J〕.Mol Biol Rep，2010；37：2423-9.

7Nguyen HL，Lee YJ，Shin J，etal.TGF-β signaling in endothelial cells，but not neuroepithelial cells，is essential for cerebral vascular development〔J〕.Lab Invest，2011;91(11)：1554-63.

8Jeong SR，Kwon MJ，Lee HG，etal.Hepatocyte growth factor reduces astrocytic scar formation and promotes axonal growth beyond glial scars after spinal cord injury〔J〕.Exp Neurol，2012;233(1)：312-22.

〔2014-12-02修回〕

(编辑李相军)