CXCR2-siRNA重组质粒治疗宫颈癌的动物实验

CXCR2-siRNA重组质粒治疗宫颈癌的动物实验

杨泽宇王钢1许晓茵2

(中国医科大学附属盛京医院超声科，辽宁沈阳110004)

摘要〔〕目的研究趋化因子受体CXCR2的siRNA质粒构建及对裸鼠移植宫颈癌的抑制作用。方法将通过人源CXCR2的基因序列设计的siRNA和质粒pDC316-EGFP-U6通过内切酶链接，同时引入胆固醇修饰，将重组质粒免疫建立好的裸鼠模式动物，通过测算评价重组质粒的治疗效果。结果琼脂糖凝胶电泳发现重组质粒大小正确，浓度合适；经过28 d的治疗，空白对照组和空质粒对照组肿瘤体积生长比较无差异(P>0．05)；重组质粒治疗组的效果明显，与前两组比较差异显著(P<0．01)，并且重组质粒治疗组的抑瘤率达到50%；荧光显微镜观察增强绿色荧光信号，产生荧光的细胞约占总细胞的8%，体内转染效果明显。结论经过本实验设计和构建的重组质粒对趋化因子受体的表达具有抑制作用，在裸鼠模式动物治疗效果中具有重要意义。

关键词〔〕siRNA；CXCR2；宫颈癌；裸鼠移植肿瘤

中图分类号〔〕R73〔文献标识码〕A〔

1中国医科大学附属盛京医院急诊科

2温州医科大学附属第二医院外科

第一作者：杨泽宇(1977-)，女，博士，主治医师，主要从事妇产科疾病诊断、产前筛查相关的分子生物学基础研究。

CXCR2属于G蛋白相关受体超家族，与趋化因子超家族CXC亚家族成员白细胞介素(IL)-8具有高度特异性和亲和力。近年来研究表明趋化因子受体在肿瘤的发展过程中起重要作用，肿瘤细胞表面受体中CXCR2与肿瘤发生、发展密切相关〔1，2〕。RNA干扰(RNAi)是在生物体内普遍存在的一种古老的生物学现象，能特异、高效地沉默靶标基因。siRNA可经由多种不同转染技术导入细胞内，并对特定基因产生具有专一性的抑制表达效果〔3～5〕。目前，RNAi已经成为研究基因功能的有效方法，并且RNAi技术具有高效性和特异性，极有可能发展成为特异性治疗肿瘤的手段。

1材料与方法

1.1siRNA序列和载体的构建根据GenBank中人源CXCR2基因序列，使用软件siRNA Target Finder设计siRNA序列，该软件由Ambion公司提供。CXCR2-siRNA序列为：正义5′GAACAAAUUUACAGAGACAUU3′；反义3′UUCUUGUUUAAAUGUCUCUGU(5′-P)5′；同时在其序列中引入内切酶位点：正向5′-AAGCTT-3′；反向5′-GGATCC-3′。siRNA由上海生工生物科技有限公司合成。

载体的选择：使用腺病毒载体siRNA穿梭质粒：pDC316-EGFP-U6，购自于北京本元正阳基因技术有限公司，其启动子是人U6启动子，同时表达EGFP。使用内切酶位点BamH Ⅰ(位于2017) 和Hind Ⅲ(位于：1997)进行基因的链接。

链接反应：反应体系为CXCR2-siRNA 2 μl(约200 ng)；Vector DN(pDC316-EGFP-U6) 1 μl(约50 ng)；H2O 2 μl；Ligation Solution1 5 μl。反应条件为：16℃，10h。链接反应使用TaKaRa公司链接试剂盒完成。

1.2质粒转化大肠杆菌将连接好的重组质粒液10 μl全量转化至E.coli JM109 Competent Cell(TaKaRa Code No.D9052)，转化过程按照说明书进行。转化后涂在含氨苄抗性的LB培养板，4℃培养16 h，挑选氨苄抗性阳性单菌落。提取阳性菌落的质粒，通过测序确定筛选到的质粒为插入CXCR2-siRNA的重组质粒，命名为：pDC316-EGFP-U6-CXCR2-siRNA。按菌液∶甘油(高压灭菌)1∶1的比例将菌种冻存于-80℃备用。

1.3重组质粒pDC316-EGFP-U6-CXCR2-siRNA的大量制备将含重组质粒pDC316-EGFP-U6-CXCR2-siRNA的菌株接种于500 ml LB氨苄培养基中培养菌株，18 h后进行质粒的大规模提取，使用质粒提取试剂盒Qiagen。空质粒pDC316-EGFP-U6的大量制备按照相同的方法进行。通过琼脂糖凝胶电泳检测重组质粒。

1.4重组质粒的胆固醇修饰脂质体购自于上海艾韦特医药科技有限公司。用吡咯烷做连接剂，在重组质粒的SV40 ployA位点连接上胆固醇得到chol-pDC316-EGFP-U6-CXCR2-siRNA。质粒结构图见图1。

图1　重组质粒基因插入结构图

1.5裸鼠动物模型的建立5～6周龄健康免疫缺陷BALB/c裸鼠18只，雌雄各半，SPF级，体重(12±2)g，购自北京生物梅里埃公司。喂养于严格消毒的无菌层流动物房内，环境温度维持在25℃，空气湿度维持在50%～70%，饲料和水经消毒处理后自由进食。

人宫颈癌Hela细胞复苏后，在37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中用含10%小牛血清的RPMI1640培养液常规培养，胰蛋白酶消化细胞并计数。取对数生长期的宫颈癌Hela细胞制成单细胞悬液，调节细胞浓度为1.8×107/ml，于每只裸鼠右前肢腋下皮下接种0.3 ml细胞悬液，接种后每天观察注射点成瘤情况，以皮下结节体积达50 mm为成瘤标准。

1.6动物实验18只裸鼠移植瘤在接种后第14天均达到成瘤标准，成瘤率为100%，称重随机分为空白对照组、空质粒对照组、重组质粒治疗组，每组6只。详细记录瘤体体积及裸鼠体重变化，测量及体积计算方法〔6，7〕：在成瘤后第1、5、9、13、17、21、25天用游标卡尺测量瘤体长短径(a、b)；肿瘤体积V(mm3)=a×b2/2；抑瘤率(%)=(1-治疗组V/对照组V)×100%。

裸鼠成瘤后第1、4、7、10、13、16、19、21天进行多点瘤内原位注射，使用分光光度计测定重症质粒的OD260值，按照1 OD=50 μg/ml换算，每只小鼠注射chol-pDC316-EGFP-U6-CXCR2-siRNA量为0.10 mg。

治疗结束后第2天数据采集后处死裸鼠，部分肿瘤组织用10%甲醛固定，部分肿瘤组织储存在液氮中备用。

2结果

2.1重组质粒的琼脂糖凝胶电泳检测将试剂盒大规模提取的质粒通过3%琼脂糖凝胶电泳检测分析，发现其大小正确，浓度合适。见图2。

图2　3%琼脂糖凝胶电泳检测重组质粒

2.2裸鼠人宫颈癌移植瘤的生长抑制各实验组均于接种细胞6 d后可触及瘤体结节，2 w后均达到实验需要的成瘤标准，成瘤率为100%。经过28 d的治疗，空白对照组和空质粒对照组肿瘤体积〔(1 529.51±23.44)mm3vs (1 499.83±36.58)mm3〕比较无差异(P>0．05)；14 d时重组质粒治疗组〔(836.27±53.19)mm3〕与前两组比较差异显著(P<0.01)。28 d时，重组质粒治疗组抑瘤率(50%)与其他各组(均0%)比较差异显著(P<0.01)。

2.3光镜观察结果取部分肿瘤组织做常规病理切片，经重组质粒治疗后的肿瘤组织切片见癌细胞出现细胞核固缩、凋亡细胞形成；而空白对照组和空质粒对照组的肿瘤组织切片可见癌细胞生长良好，核分裂相多见。重组质粒治疗组荷瘤裸鼠的肺、肝脏、肾脏组织病理切片显示正常表现，未发现转移灶。

2.4移植瘤组织中EGFP荧光信号的检测经过重组质粒治疗后，将裸鼠肿瘤组织用10%甲醛固定，荧光电镜下观察增强绿色荧光蛋白EGFP荧光信号。观察发现肿瘤组织出现绿色荧光，产生荧光的细胞约占总细胞的8%，说明重组质粒成功转染到周围肿瘤组织，稳定表达外源的EGFP。见图3。

图3　荧光显微镜观察重组质粒治疗组肿瘤组织中 EGFP荧光信号

3讨论

宫颈癌是女性第二大常见的恶性肿瘤，早期可发生淋巴转移，且近年发现有年轻化趋势。宫颈癌治疗早期以手术为主、辅以放化疗，晚期放疗为主、辅以化疗，但仍然需要补充新疗法，其中基因治疗被认为是最有前途和挑战性的研究方向之一，而目前基因治疗的研究热点是RNAi技术。siRNA分子是RNAi过程中的中间产物，通常是一段长20～25个核苷酸的双链RNA，双链分别在RNA 3′端超出另一端两个核苷酸，这种结构是DICER酶处理而来。siRNA可经由多种不同转染技术导入细胞内，并对特定基因产生具有专一性的抑制表达效果。经过实验证实这种设计是可行有效的〔5～9〕。

在穿梭质粒载体上的选择上，本研究选择腺病毒载体siRNA穿梭质粒pDC316-EGFP-U6。该质粒以pDC316质粒为骨架改造，启动子是人U6启动子，为在人类宫颈癌基因治疗中的应用提供前提准备。同时表达EGFP，便于示踪和估计转导效率。另外，该质粒包括多种抗性基因，便于平板筛选阳性克隆。包括SV40ployA，有利于后续加工和修改。

EGFP是荧光分子，它的荧光强度是绿色荧光蛋白(GFP)的35倍，通过荧光显微镜能够观察重组质粒的传染效率。在细胞质中有104个或细胞表面有2×103个EGFP分子时，即可被流式细胞仪或荧光显微镜检测到。因此，另可以直接用于检测活细胞内的基因表达。

基因的靶向治疗中，由于组织或血液中存有大量的核酸酶，会直接导致RNA药物分子的迅速降解，使得RNAi机制丧失或药效丢失。所以如何有效解决裸RNA药物分子在血液中的稳定性十分关键〔6～10〕。 一般的解决方案包括：化学修饰RNA分子二甲基化修饰或胆固醇修饰等；利用功能高分子或脂质体载体包裹裸RNA药物分子。本研究中一是选择胆固醇修饰，用吡咯烷做连接剂，在重组质粒的SV40 ployA位点连接上胆固醇得到chol-pDC316-EGFP-U6-CXCR2-siRNA；另外，使用聚乙烯吡咯烷酮(分子量6 000的PVP)修饰脂质体。聚乙烯吡咯烷酮作为一种两亲性聚合物，具有良好的生物相容性，可用作脂质体立体保护剂。这样不仅解决了RNA药物分子在组织中的稳定性，也可以解决RNA药物分子在全身传输中的组织器官靶向性难题，使其能够到达指定肿瘤组织中发挥抑制作用。本研究为siRNA基因靶向治疗宫颈癌提供了研究基础。

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〔2014-09-15修回〕

(编辑曲莉/滕欣航)