不同抗生素检测方法检测乳清粉样品结果差异性分析

文∕王媛媛 王 攀 刘晓辉 赵亭亭 杨婧悦 于景华* 姜中航 骆志刚

（1天津科技大学食品工程与生物技术学院；2北京银河路经贸有限公司）

脱盐乳清粉是婴幼儿配方乳粉生产的重要原料，其主要成分是乳清蛋白和乳糖，在婴幼儿配方乳粉生产中用来调节乳清蛋白和酪蛋白的比例[1，2]。近年来，人们对各种乳制品中的抗生素指标非常重视，尤其是婴儿乳粉。因此，作为婴儿乳粉主要原料的脱盐乳清粉，抗生素指标的检测就显得尤为重要。目前用来检测生鲜乳、液态乳和乳粉中抗生素的方法很多，主要分为微生物法和免疫法[3]。国家标准规定的标准抗生素检测方法有：国标法1（TTC法）、国标法2（嗜热脂肪芽孢杆菌法）；快速检测中应用比较多的则是微生物法试剂盒和酶联免疫法快速检测试剂盒[4，5]。乳品厂家因其方便性或自认为的可靠性而在乳清类配料抗生素检测上沿用上述某一种快速检测方法。但实际上由于每一种检测方法的原理和适用条件不同，因此得出的检测结果未必真实地反映检测对象的抗生素状况。本研究以D90脱盐乳清粉为样品，采用不同的检测方法对抗生素进行检测，比较了不同检测方法间检测结果的差异性，并对其进行客观地分析，以期为生产企业正确选用检测方法提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

脱盐乳清粉D90（爱尔兰DAIRYGOLD公司生产）、脱脂乳粉（新西兰）；青霉素（索莱宝生物制剂有限公司）；嗜热链球菌（中国科学院微生物研究所CGMCC 1.3996）、嗜热脂肪芽孢杆菌（中国工业微生物菌种保藏管理中心CICC 10392）；利普斯50试剂盒（西班牙ZEU-INMUNOTEC，S.L.）、Charm MRL β-内酰胺快速检测条（北京博欧实德生物技术有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 样品理化指标检测

p H 值用p H 计直接测定；灰分测定参照国标GB 5009.4—2010；乳糖测定参照国标GB 54135—2010；蛋白质组成分析采用SDS-Page法[6]。

1.2.2 抗生素检测

8 个乳清粉样品采用10%的复原液。以10%的无抗灭菌脱脂乳粉复原液作为阴性对照，以附加青霉素的灭菌脱脂乳复原液为阳性对照。分别按照国标法1（GB/T 4789.27—2008）（嗜热链球菌抑制法）、国标法2（GB/T 4789.27—2008）（嗜热脂肪芽孢杆菌抑制法）进行检测。

1.2.3 利普斯50试剂盒法

样品准备：乳清粉样品配置成10%复原样品，同时做阴性和阳性对照各1 份，阳性对照为青霉素G参照液（精密称取青霉素G钾盐标准品，溶于无菌磷酸盐缓冲液中，使其浓度为100～1 000 IU/mL，再用无抗生素的灭菌脱脂乳稀释至0.006 IU/mL），阴性对照为不含抗生素的脱脂乳。具体检测操作见说明书。

1.2.4 Charm MRL β-内酰胺快速检测条法（酶联免疫层析法）

样品准备：经10%复原乳清粉样品，检测前在（1 200±200）g下离心3 min，静置后取澄清部分进行检测。另使用β-内酰胺阴性样品作为阴性质控，用6 mL阴性质控复原青霉素G阳性质控片剂，配置成（4.0±0.4）mg/kg的青霉素阳性质控。具体检测操作和判定方法见说明书。

2 结果与讨论

2.1 样品部分理化指标检测结果

8 个乳清粉样品的pH值、灰分和乳糖等生化指标测定结果见表1。从表1可以看出，8 个乳清粉样品的pH值、灰分、乳糖含量检测结果没有明显差异。8 个样品的SDS-Page分析见图1。从图1-A的非还原胶电泳与图1-B还原胶电泳结果比较可见，8 个样品的蛋白质组成主要为：乳铁蛋白（If）、牛血清蛋白（BSA）、免疫球蛋白（Ig）、β-乳球蛋白和α-乳白蛋白。在图1-A上部可见复聚的大分子蛋白质。而样品经过β-巯基乙醇还原后电泳图1-B中可见，复聚物均被还原为上述5 种蛋白质单体，其中免疫球蛋白Ig还原为轻链IgL和重链IgH，这表明5 种蛋白质成分均有少量通过二硫键参与附聚物形成。但综合比较8 个样品的蛋白质组成和变性程度没有明显差异。

表1 乳清粉样品理化指标

图1 乳清粉样品SDS-PAGE 电泳分析

2.2 样品抗生素检测结果

8 个乳清粉样品抗生素的检测结果见表2。由表2可见，按照国标GB/T 4789.27—2008所述方法1进行8 个样品的抗生素检测，结果均为阴性，即样品均不含抗生素。而按照国标GB/T 4789.27—2008所述方法2的检测结果则与前者截然相反，8 个样品均显示为抗生素阳性。依据利普斯50试剂盒法检测结果显示，样品4号、5号、6号为阳性，样品7号为弱阳性，即样品所含抗生素的量接近检出限；其余1号、2号、3号和8号样品为阴性。Charm MRL β-内酰胺快速检测条法检测结果显示，8 个样品抗生素检测结果均为阴性，即未检出抗生素。

表2 8 个乳清粉样品的抗生素检测结果

本研究所采用的4 种抗生素检测方法中，国标法1和国标法2为国家推荐的乳制品抗生素检测方法，均为微生物法。二者的原理均是以菌体是否正常生长增殖产酸，进而使指示剂变色与否来作为样品中抗生素检测的判断指标。

国标法1是以嗜热链球菌为检测菌，利用嗜热链球菌在杀菌后的样品中是否增殖产酸，并使指示剂2,3,5-氯化三苯四氮唑（TTC）变色来判明样品中是否含有抗生素。此方法嗜热链球菌的增殖产酸主要依靠检测样品中营养物质是否满足嗜热链球菌生长条件。嗜热链球菌最适生长温度为42 ℃，而生长温度范围为35～45 ℃，对温度变动相对不甚敏感，在适宜条件下增殖迅速。但该菌对抗生素等生长抑制剂敏感，同时，该菌株也是酸奶生产菌种同类菌株，因此，该方法也被绝大多数酸奶生产厂家验收原料奶时用于抗生素检测。所以，在本研究中8 个样品检测结果均显示为抗生素阴性，检测结果是可靠的。当然，本方法也有一定的局限，就是当检测样品中的营养物质不够丰富时，如样品为乳清分离蛋白（WPI）时会因菌体生长受限而造成假阳性或阴性结果不明显的现象。

国标法2则从原理上弥补了国标法1的不足：它是在含有pH指示剂（溴甲酚紫）的培养基预先混合嗜热脂肪芽孢杆菌，加入样品并孵育后，若该样品中不含有抗生素或抗生素的浓度低于检测限，细菌芽孢将在培养基中生长并利用糖产酸，pH指示剂由紫色变为黄色。相反，如果样品中含有高于检测限的抗生素，则细菌芽孢生长受到抑制，pH指示剂的颜色保持不变，仍为紫色。因此，国标法2是专门针对像乳清分离蛋白（WPI）或浓缩乳清蛋白（WPC50）以上的这类营养源缺乏的产品开发的。

利普斯50的检测试剂盒是基于国标法2的检测原理开发的一种快速检测试剂盒。它是在检测试剂盒的微孔注入嗜热脂肪芽孢杆菌孢子和酸碱指示剂溴甲酚紫的琼脂培养基。

本研究中用国标法2对8 个理化指标相近样品的抗生素检测结果全部显示为阳性，与国标法1的结果截然相反。究其原因，可能是由于国标法2中的嗜热脂肪芽孢杆菌的菌体热激后能否产生95%的芽孢很难确定；同时产生的芽孢对温度和培养条件比较敏感，温度波动可能会使芽孢生长受到影响，这2 种情况都会造成假阳性检测结果。利普斯50试剂盒避免了国标法2细菌孢子不足的影响，也在培养温度条件上加以完善，配有专门的加热设备。但是利普斯50试剂盒的检测结果也和国标方法2有50%的结果是相互矛盾。由此可见，嗜热脂肪芽孢杆菌法作为乳清粉抗生素检测手段，其中存在诸多造成假阳性的因素，其抗生素检测的稳定性和可靠性均有待进一步研究。

Charm MRL β-内酰胺快速检测条法属于酶联免疫层析法，较之国标法1、国标法2、利普斯50试剂盒法，大大缩短了检测时间，且酶联免疫方法特异性高，准确度好，是国际上比较通用的方法。在本研究中8 个乳清粉样品检测结果全部为阴性。这种方法尽管仅对青霉素类和头孢类抗生素有效，但已在一定程度上佐证了国标法1的检测结果。

3 结论

本研究对8 个在理化指标上相近的乳清粉产品进行了抗生素检测，结果表明国标法1和Charm MRL β-内酰胺快速检测条法检测结果完全相同，全部为阴性。而国标法2和依据国标法2原理开发的利普斯50试剂盒检测结果不仅与前两者不同，而且二者之间亦有出入，8 个样品抗生素检测结果分别显示为全部阳性和部分阳性。分析认为，针对乳清制品，营养源丰富的产品，如乳清粉、低蛋白质含量的乳清浓缩蛋白均可以采用国标法1，即TTC试剂法来进行抗生素的检测，不仅可靠、方便，而且检测结果具有仲裁效力。而营养源缺乏的乳清产品，如乳清分离蛋白（WPI）等，可使用国标方法2，但一定注意温度控制及产芽孢率等，避免检测出假阳性结果。

[1]张和平，张列兵.现代乳品工业手册.北京：中国轻工业出版社，2012.

[2]赵娟娟，徐丽，生庆海.脱盐乳清粉及脱脂乳粉理化指标的跟踪检测.中国乳品工业，2009，39（1）：33-36.

[3]陈云，李洪亮，张冬洁，等.乳中抗生素残留及其检测方法的研究进展.中国乳品工业，2012，40（9）：35-39.

[4]李晓红，菲菲，迟涛.乳中抗生素残留及其检测方法.中国乳品工业，2010，38（11）：36-40.

[5]何士敏，魏庆梅，李盛贤.牛奶中青霉素含量的快速检测.中国乳品工业，2000，28（3）：36-37，43.

[6]Patel H A，Singh H，Anema S G，et al.Effects of heat and high hydrostatic pressure treatments on the aggregation of whey proteins in whey protein concentrate solutions.Food New Zealand，2004（4）：29-35.