抑制URG4表达对宫颈癌小鼠的治疗作用及机制

周　曦　陈忠东　何　璐　(南华大学附一医院妇产科，衡阳421001)



抑制URG4表达对宫颈癌小鼠的治疗作用及机制

周曦陈忠东何璐(南华大学附一医院妇产科，衡阳421001)

［摘要］目的:分析上调基因-4(URG4)在宫颈癌中的表达，并观察分析抑制URG4对宫颈癌的治疗作用及机制。方法: Western blot法分析URG4在宫颈癌组织及癌旁组织中的表达差异。选择16只雄性BALB/c裸鼠，喂养至6周龄后随机分为对照组(Control组)及观察组(Observation组)，每组各8只。Control组小鼠于右侧背部皮下接种宫颈癌细胞(SiHa cells)。Observation组小鼠背部皮下接种URG4-siRNA转染的宫颈癌细胞(URG4-siRNA SiHa cells)。干预后4周处死小鼠，分析对比小鼠肿瘤生长情况及Wnt/β-catenin信号通路的改变。结果: URG4在人宫颈癌组织中呈现高表达，显著高于癌旁组织(P＜0.05)。干预结束后，观察组小鼠肿瘤组织内URG4表达量显著低于对照组(P＜0.05) ;体重明显高于对照组(P＜0.05) ;肿瘤组织重量显著低于对照组(P＜0.05)。观察组小鼠肿瘤组织内Ki67表达量显著低于对照组(P＜0.05)。观察组小鼠肿瘤组织内CyclinD1、β-catenin及C-myc的表达均显著低于对照组，相比较差异均具有统计学意义(P＜0.05)。结论: URG4在人宫颈癌中呈现高表达，抑制URG4的表达可能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路而发挥抗肿瘤效应。

［关键词］宫颈癌;上调基因-4; Wnt/β-catenin信号通路

Analyze curative effect of suppression expression of URG4 on cervical cancer mice and possible mechanisms

ZHOU Xi，CHEN Zhong-Dong，HE Lu.Department of Gynaecology and Obstetrics，the First Affiliated Hospital of South China University，Hengyang 421001，China

［Abstract］Objective: To analyze the curative effect of suppression expression of URG4 on cervical cancer mice and the possible mechanisms.Methods: The expression of URG4 were analyzed in cervical cancer tissues and para-carcinoma tissues.16 male BALB/c nude mice were divided into Group A (inoculated with URG4-siRNA SiHa cells) and Group B (inoculated with SiHa cells)．After 4 weeks，mice were executed and analyzed.Results: The expression of URG4 were higher in human cervical cancer tissues than that in para-carcinoma tissues (P＜0.05) .After experiment，Group A had a lower tumor weight，but a higher body weight than these of Group B，the difference was statistically significant (P＜0.05) .Group A mice had a lower levels of URG4 in tumor than that of Group B mice (P＜0.05) .Group A mice had a lower levels of Ki67 in tumor than that of Group B mice，the difference was statistically significant (P＜0.05) .Group A mice had lower levels of CyclinD1，β-catenin and C-myc in tumor than these of Group B mice (P＜0.05)．Conclusion: The expression of URG4 in cervical cancer tissue is up-regulation.Suppression expression of URG4 can suppress tumor growth in vivo，which may though suppress the Wnt/β-catenin signaling pathway.

［Key words］Cervical cancer; Upregulated gene 4; Wnt/β-catenin signaling pathway

宫颈癌(Cervical cancer)是临床常见的妇科肿瘤，其发病率呈现升高趋势，且具有年轻化倾向［1］。宫颈癌主要的病理类型为宫颈鳞癌，呈现为浸润性生长。患者早期缺乏特异性的临床表现，可仅表现为阴道接触性出血或阴道排出血性、脓性分泌物。虽然以手术为主的综合治疗大大降低了该病的死亡率，但仍然有相当患者由于延误诊断或治疗而预后不良。迄今为止宫颈癌的发病机制尚不清楚，目前认为与遗传、环境污染、病毒感染及不健康的性生活有关［2］。上调基因-4(Upregulated gene 4，URG4)位于人染色体7p13，是新近发现的促癌相关基因。URG4被证实在胃癌、神经母细胞瘤及淋巴细胞白血病等恶性肿瘤中表达升高，且与预后密切相关［3-5］。目前URG4与宫颈癌的关系尚无充分研究。本文尝试分析URG4在人宫颈癌组织中的表达，并建立宫颈癌动物模型，观察抑制URG4表达对宫颈癌是否有治疗作用。

1　材料与方法

1.1临床标本收集及检测收集2014年1月至2015年1月我院收治的10例宫颈癌患者的手术标本。共纳入10例患者，均经手术病理确诊为宫颈鳞癌，平均年龄(49±3.9)岁。采集标本包括癌组织及癌旁组织(正常宫颈组织)，分别冻存(－80℃)。采用Western blot法分别检测宫颈癌组织(Cervical cancer)及癌旁组织(Para-carcinoma)内URG4的表达。

1.2建立宫颈癌动物模型及干预选择16只4周龄雄性BALB/c背景的裸鼠，均饲养在无特定病原菌级(Specific pathogen Free，SPF)环境中。保持饲养环境中每日12 h光照，维持室温在20℃～24℃;避免强噪音及光线刺激;小鼠自由饮水，普通饲料喂养。待小鼠喂养至6周龄后随机分为对照组(Control组)及观察组(Observation组)，每组各8只。

两组小鼠分别接受如下4周干预: Control组小鼠于右侧背部皮下接种宫颈癌细胞(SiHa cells; 1× 107，0.2 ml; Ambion公司，USA) ; Observation组小鼠背部皮下接种URG4-siRNA转染的宫颈癌细胞(URG4-siRNA SiHa cells; 1×107，0.2 ml)。URG4-siRNA SiHa cells由Ambion公司(USA)提供，URG4-siRNA转染SiHa cells采用慢病毒载体，转染效率75%，URG4-siRNA序列为: Sense: 5'-gatccgtagaccactcacatgtcctttcaagagaaggacatgtgagtggtctattttttggaaa-3'，Anti-sense: 5'-agcttttccaaaaaata-gaccactcacatgtccttctcttgaaaggacatgtgagtggtctacg-3'。细胞培养5代后开始用于实验。

1.3观察指标及检测干预周期内，每周称量小鼠体重并记录; 4周后处死小鼠，剥离背部肿瘤组织保存(福尔马林固定、－80℃冻存)，行如下检测:采用Western blot法及免疫组化法检测肿瘤组织内URG4及细胞增殖抗原标记物(Ki67)的表达;采用Western blot法检测肿瘤组织内细胞周期蛋白(CyclinD1)、β-链蛋白(β-catenin)及原癌基因(C-myc)的表达。所有抗体均订购于Abcam公司(Britain)。

Western blot方法简述为:研磨并提取组织蛋白，使用Bradford法行蛋白定量，然后在沸水中加热10 min，吸取35 μg蛋白加入孔，后电泳、转膜，封闭1小时后加入URG4、CyclinD1、C-myc、β-catenin、Ki67及β-actin(1∶800稀释，鼠源性单抗，Abcam公司)一抗稀释液，4℃下摇床12 h，加入二抗后洗膜，滴加ECL显影液，行灰度值分析(Image J软件; USA)。免疫组化方法简述:常规石蜡切片(4微米)，60℃烤片约8 h，行抗原修复后滴加一抗(分别为URG4、Ki67; 1∶50稀释，鼠源性单抗，Abcam公司)，室温下孵育60 min后滴加二抗(羊抗兔IgG， Santa cruz，USA)，室温孵育10 min后采用PBS冲洗3次，滴加DAB显色剂，苏木素复染，封片。

1.4统计学方法数据分析基于SPSS19.0统计分析软件。连续性变量以x ±s表示，比较采用t检验。计数资料的比较采用χ2检验。P＜0.05定义为有统计学差异。

2　结果

2.1 URG4在宫颈癌组织中的表达如图1所示，Western blot半定量分析显示URG4在人宫颈癌组织中呈现高表达，显著高于癌旁组织，差异具有统计学意义(P＜0.05)。

2.2比较两组小鼠肿瘤组织内URG4的表达差异

如图2A所示，免疫组化染色证实:观察组小鼠肿瘤组织内URG4表达量显著低于对照组，相比较差异具有统计学意义(P＜0.05)。Western blot分析进一步证实了这一结果(图2B)。

2.3抑制URG4表达对宫颈癌小鼠体重及肿瘤生长的影响图3A所示，实验第3、4周，观察组小鼠体重明显高于对照组，相比较差异均具有统计学意义(P＜0.05)。如图3B，观察组小鼠肿瘤组织重量显著低于对照组，差异具有统计学意义(P＜0.05)。

2.4抑制URG4表达对宫颈癌小鼠肿瘤内Ki67表达的影响如图4A所示，免疫组化分析显示:观察组小鼠肿瘤组织内Ki67表达量显著低于对照组，差异具有统计学意义(P＜0.05)。Western blot分析进一步证实了这一结果(图4B)。

Note: * .P＜0.05.

2.5抑制URG4对小鼠肿瘤组织内Wnt/β-catenin信号通路的影响Western blot分析显示(图5)，观察组小鼠肿瘤组织内CyclinD1、β-catenin及C-myc的表达均显著低于对照组，相比较差异均具有统计学意义(P＜0.05)。

Note: A.Immunohistochemical analysis show the expression of URG4 (Brown) in the two groups; B.The comparison of URG4 expression between the two group mice.

Note: A.Immunohistochemical analysis show the expression of Ki67 (Brown) in the two groups; B.The comparison of Ki67 expression between the two group mice.

图3　两组小鼠体重及肿瘤重量的比较Fig．3 Comparison of weight and tumor size between two groups

Note: The comparison of Cyclin D1，β-catenin，C-myc expression between two group，* .P＜0.05.

3　讨论

宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤，严重威胁患者生命健康。尽管近几十年肿瘤学科有了长足的发展与进步，但仍然未能全面揭示其发病机制。目前认为其是遗传易感个体在环境因素作用下发病。URG4的基因位于人体第7号染色体，能够编码超过900余种氨基酸。URG4具有多种生物学功能，其可以促进肿瘤细胞的增殖及转移。目前发现URG4在多种恶性肿瘤组织中呈现高表达，包括子宫内膜癌、卵巢癌等［6-8］，说明其与生殖系统肿瘤的发展与发展密切相关。目前URG4在宫颈癌发生与发展过程中的作用尚不十分明确。本文尝试首先分析宫颈癌肿瘤组织内URG4的表达是否有改变。在此基础上进一步建立宫颈癌动物模型，分析抑制URG4是否可以抑制肿瘤生长，并分析可能的机制。

我们的研究发现，URG4在宫颈癌中呈现高表达，显著高于癌旁组织，这提示URG4可能与肿瘤的发生与发展有关。为了明确URG4对宫颈癌的发展是否有关，我们建立了宫颈癌小鼠模型。我们采用免疫组化及Western blot两种方法均证实接种URG4-siRNA转染的宫颈癌细胞的小鼠(观察组)，其肿瘤组织内URG4的表达显著低于对照组。进一步分析发现观察组小鼠肿瘤重量显著低于对照组，但平均体重显著高于对照组。这提示抑制URG4表达显著抑制了肿瘤生长，并同时改善了小鼠全身状况。我们进一步分析了两组小鼠肿瘤组织内Ki67的表达，发现观察组小鼠肿瘤组织内Ki67表达显著低于对照组。Ki67是一种由MKI-67基因编码的核蛋白质，主要表达于增生活跃的细胞中，是常用的细胞增殖标记物［9，10］。这提示抑制URG4表达，显著抑制了肿瘤细胞增殖，发挥了抗肿瘤的作用。为了明确抑制URG4而达到抗肿瘤的机制，我们进一步分析了小鼠肿瘤组织内Wnt/β-catenin信号通路的改变。我们发现Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白(CyclinD1、β-catenin及C-myc)在观察组小鼠肿瘤组织内表达均显著低于对照组。CyclinD1是一种细胞周期调节因子，其表达具有严格的细胞周期顺序性，主要表达于细胞周期的G1期与S期。CyclinD1的过度表达与多种人类原发恶性肿瘤相关，也是肿瘤诊断与预后判断的重要指标［11］。C-myc与多种肿瘤的发生相关，是促使细胞无限增殖恶性化的主要调节基因［12］。β-catenin是Wnt/β-catenin信号传导途径中的关键调控因子，其在多种肿瘤组织呈现高表达，可以促进肿瘤细胞增殖［13，14］。此外，βcatenin还可上调C-myc及CyclinD1的表达［15］。我们的研究显示抑制URG4的表达可以抑制Wnt/βcatenin信号通路，这可能是其发挥抗肿瘤作用的机制之一。

我们的研究显示，URG4在人宫颈癌中呈现高表达，抑制URG4的表达可能通过抑制Wnt/βcatenin信号通路而发挥抗肿瘤效应。

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［收稿2015-06-20修回2015-07-07］

(编辑许四平)

doi:10．3969/j．issn．1000-484X．2015．10．023

作者简介:周曦(1973年－)，女，副主任医师，副教授，主要从事妇科肿瘤方面研究。

文章编号1000-484X(2015) 10-1400-04

文献标志码A

中图分类号R737