中国乳菇属一新记录种的形态学及分子鉴定*

田慧敏，刘铁志，毕晓丹

（赤峰学院生命科学学院，内蒙古 赤峰 024000）

〈资源开发〉

中国乳菇属一新记录种的形态学及分子鉴定*

田慧敏，刘铁志，毕晓丹

（赤峰学院生命科学学院，内蒙古 赤峰 024000）

采用形态描述及分子鉴定采自中国内蒙古自治区赤峰市赛罕乌拉自然保护区的群生标本，确定为中国乳菇属一新记录种（Lactarius scoticus）。主要鉴别特征是菌盖直径3.6 cm～6 cm，半球形，中部稍下凹，白色或污白色，表面光滑，中间色深，赭黄色或金黄色，边缘内卷并有绒毛；菌肉白色，受伤后变淡黄色，厚，具有轻微辣味，乳汁白色，不变色。菌褶白色、密、延生。菌柄白色，孢子无色，椭圆形，有小刺，大小（6～7.2）μm×（4.8～7.0） μm；担子棒状，（28.8～38.4） μm×（7.2～9.6） μm；褶侧囊状体近梭形，（28.8～53.2） μm×（6.7～8.4）μm；褶缘囊体与侧囊体形状相似。菌盖表皮由杂乱的菌丝组成，有丰富的乳管，菌丝无色有隔膜，直径4.3 μm～7.2 μm，菌盖表皮具囊状体，棒状，有隔膜，（48～67.2）μm×（12～14.4）μm。经分子鉴定，标本与Lactarius scoticus聚在一枝，属于乳菇属（Lactarius）辣乳菇亚属（Piperates）Aspideini组，支持率为76%。

乳菇属；中国新记录种；分子鉴定

乳菇属（Lactarius）属于担子菌门（Basidiomycotina）伞菌目（Agaricales）红菇科（Russulaceae）。主要特点是子实体肉质，菌盖下凹，常具脐状，同心环纹有或无，色泽多样，表面光滑，被短毛至被长毛。菌褶延生，菌肉具有大量的球状细胞和产乳系统；孢子在显微镜下无色至淡黄色，通常球形至宽椭圆形，具有小疣或小刺，常具有囊状体[1]。乳菇属生长在林中地上，通常与高等植物形成菌根，在生态系统中起着重要的作用，分布广泛。在实际鉴定中仅用传统分类法，经常出现错误或产生争议。因此许多菌物学鉴定时常辅以分子手段。

ITS是rDNA中的非编码转录间隔区，该区保守性强，在绝大多数真核生物中表现出较高的序列多态性。国内外许多菌物学家利用rDNA-ITS全序列测序对乳菇属下的种类进行鉴定，如松乳菇（Lactarius deliciosus）[2-4]、橙红乳菇（L.akahatsu） 以及红汁乳菇（L.hatsudake）[5]等。本文对采自内蒙古的一个乳菇属新记录种进行分类鉴定。

1 材料与方法

1.1供试标本

供试标本子实体10069于2013年8月间采自赛罕乌拉自然保护区，标本晾干后，编号、分类、鉴定，超低温冷冻后存于赤峰学院菌物标本室（CFSZ）。

1.2形态鉴定

鉴定方法采用宏观特征、显微结构与化学试剂反应相结合的方法。宏观观察使用体式显微镜，颜色的判断主要依据采集时拍摄的彩色照片，大小用游标卡尺测量新鲜子实体2个～5个，显微观察通常4%～5%KOH作浮载剂。测量孢子30个，菌丝、囊状体、担子各15个。

1.3ITS鉴定

1.3.1 基因组DNA的提取

采用CTAB法：子实体干品菌盖部分（含菌褶）用液氮研磨，提取基因组DNA[2]，并使用北京鼎国公司的DNA纯化试剂盒对提取的DNA进行纯化。

1.3.2 rDNA-ITS区PCR扩增及测序

ITS-PCR的扩增体系为：PCR colorless mix 25 μL，20 μmol·L-1ITS1/ITS4引物（TCCGTAGGTG AAC CTGCGC/TCCTCCGCTTATTGATATGC）各0.5 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 22 μL，反应总体积为50 μL。扩增反应在德国Eppendorf公司的5331型PCR扩增仪上进行，94℃预变性3 min，95℃变性40 s，58℃退火40 s，72℃延伸1 min，共34个循环；最后于72℃补平5 min，终止温度为4℃。PCR产物纯化后委托上海生工生物科技有限公司完成测序。

1.3.3 ITS序列比较和系统发育分析

将已测得的ITS序列，转换为FASTA格式，用MEGA5.1软件Alignment程序，对其与从GenBank中通过BLAST检索获得的参考序列进行多重对位排比，并构建系统发育树，用Kimura2-parameter模式计算遗传距离，采用邻位相连法进行进化距离分析。

2 结果与分析

2.1形态学特征描述

Lactarius scoticusBerk.&Broome，菌盖直径3.6 cm～6 cm，半球形，中部稍下凹，白色或污白色，表面光滑，中间色深，赭黄色或金黄色，边缘内卷并有绒毛；菌肉白色，受伤变淡黄色，厚，具有轻微辣味，近柄处厚2 mm～4 mm，乳汁白色，不变色。菌褶白色、密、延生，等长。菌柄白色，圆柱形，长2.0 cm～2.4 cm，粗0.6 cm～0.9 cm，实心；孢子无色，椭圆形，有小刺，大小（6～7.2）μm×（4.8～7.0）μm；担子棒状，无色，具4个小梗，（28.8～38.4）μm×（7.2～9.6）μm；褶侧囊状体无色，有金黄色内含物，近梭形，（28.8～53.2） μm×（6.7～8.4） μm；褶缘囊体与侧囊体形状相似。菌盖表皮由杂乱的菌丝组成，有丰富的乳管，菌丝无色有隔膜，有的顶端膨大，直径4.3 μm～6.2 μm，菌盖囊状体头状，有隔膜，（48～67.2） μm×（12～14.4） μm。菌柄表皮由泡囊细胞和菌丝组成，细胞 （16.8～50） μm×（14.4～50）μm。

鉴定标本来自内蒙古赤峰市巴林右旗赛罕乌拉自然保护区东沟白桦林地上，群生，田慧敏、刘铁志等于2013年8月14日采集。

图1 乳菇属标本10069外形特征及显微结构Fig.1 Morphology and microstructure of Lactarius sp.10069

2.2rDNA-ITS的鉴定

PCR扩增的样品子实体DNA的ITS序列，经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，鉴定标本10069ITS片段长度约为710 bp，与测序结果相符。

2.3系统发育分析

鉴定标本10069 ITS序列系统发育树见图2。

图2 鉴定标本10069及来自Genbank的最相似物种的ITS序列构建的NJ系统发育树Fig.2 NJ phylogenetic tree of ITS for Lactarius sp.10069 and the similar speices from Genbank

分析结果表明，12个种序列聚为两大类，即红菇属（Russula）和乳菇属（Lactarius），乳菇属又明显分为乳菇亚属（Lactarius）和辣乳菇亚属（Piperates）。前者属下有Lactarius salmonicolor和Lactarius sanguifluus。辣乳菇亚属又分为Aspideini组和Piperates组。前者组下有Lactarius pubescens、Lactarius scoticus和Lactarius tesquorum三个种。而Piperates组下仅有Lactarius zonariodess一种。乳菇属标本10069与Lactarius scoticus聚在一枝，属于辣乳菇亚属（Piperates）Aspideini组，支持率为76%。

3 讨论

本研究中，乳菇属标本10069分子数据显示与Lactariuspubescens、Lactariusscoticus、Lactarius tesquorum亲缘关系较近。但是Lactarius tesquorum孢子大小为（7～9）μm×（5～7）μm，明显大于乳菇属标本10069；而绒边乳菇（Lactarius pubescens）子实体及囊状体远大于乳菇属标本10069，分别为5 cm～10 cm、（50～60）μm×（8～10） μm，且绒边乳菇（Lactarius pubescens）和Lactarius tesquorum菌盖多为浅土黄色、乳白色，表面具长绒毛，边缘具纤维质粗毛，外形差异较大[6-8]。而供试标本10069的菌盖1.4 cm～6 cm，基本都为白色或灰白色，表面无绒毛，但具有似毛状纹理，边缘常常具长毛，1 mm～2 mm，菌盖中央为金黄色或赭黄色，这是该标本显著特征。孢子（5.5～7.5） μm×（5～6） μm，担子（30～45） μm×（7～9） μm[7]。鉴定标本与Lactarius scoticus完全相符合。

Lactarius scoticusBerk.&Broome于1879年首次在欧洲苏格兰高地被发现，随后发现在德国、英国、法国均有分布。由于与绒边乳菇亲缘关系较近，1991年Krieglst修订命名为Lactarius pubescensvar.scoticus(Berk.&Broome)Krieglst[9]，而作者认为该种与绒边乳菇Lactarius pubescens差异较大，仍沿用Lactarius scoticusBerk.。该种主要分布于欧洲，在中国未见记录。

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[4]熊涛，肖满，曾哲灵.松乳菇组织分离菌株的rDNA-ITS序列分子鉴定[J].微生物学通报，2006，33（4）：1-4.

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Mocular Identification and Morphology of Lactarius sp.,a New Record of China

TIAN Hui-min,LIU Tie-zhi,BI Xiao-dan
(College of Life Science,Chifeng University,Chifeng 024000,China)

A newly recorded specie ofLactarius(Lactarius scoticus)from China was described in this paper,and the specimen were collected from Saihanwula Reserve of Chifeng city,Inner Mongolia,China.The main distinguishing feature is as follows: the cap is hemispherical,central slightly concave,white or dirty white with ocher yellow or golden yellow in the centre,surface smooth,and the flush is white and becomes yellow when injury,and tastes spicy.The milk is white and no discoloration.Gills are white,dense,and spores are colorless,oval-shaped,with small spines,(6-7.2)μm×(4.8-7.0)μm.Basidia are clavate，(28.8-38.4)μm×(7.2-9.6)μm.Pleurocystides are fusiform,(28.8-53.2)μm×(6.7-8.4)μm.Cheilocystides are similar to Pleurocystides.Epidermal mycelium of cap is composed by messy mycelium,4.3 μm-7.2 μm,with rich milk ducts,Pileipellis septum [(48-67.2)μm×(12-14.4)μm].The specimen gathered withLactarius scoticusat a branch by the molecular identification.It was belonging to the genusLactariuswith support rate 76%.

Lactarius;a new record of China;classification and description

S646.9

A

1003-8310（2015）04-0013-03

10.13629/j.cnki.53-1054.2015.04.003

内蒙古自然科学基金项目（2012MS0501）；内蒙古高等学校科学研究项目（NJZY12309）。

田慧敏（1980-），女，硕士，讲师，主要从事菌物多样性研究。E-mail:tiancfxy2009@126.com

2015-04-28