高效液相色谱—蒸发光散射法检测雪胆溶液中雪胆甲素的研究

骆延波　刘晓东　胡明　李璐璐　齐静　刘玉庆

摘要：采用HPLC-ELS法，C18柱（4.6mm×250mm），流动相为乙腈-水（40：60）；流速0.8mL/min；柱温为室温；检测器为Alltech 2000蒸发光散射检测器；检测温度100℃；ELSD载气为高纯氮气；载气压力为0.35MPa，对雪胆溶液中雪胆甲素含量进行测定。结果表明：在该方法下，雪胆甲素进样量在3.34～16.70μg之间，进样量的自然对数与峰面积积分值的自然对数呈良好的线性关系，其平均回收率为98.81%，RSD为0.92%（n=6）。所建方法简便易行、准确可靠，可用于雪胆溶液中雪胆甲素含量的测定。

关键词：雪胆溶液；雪胆甲素；高效液相色谱-蒸发光散射法；含量测定

中图分类号：S853.73

文献标识号：A

文章编号：1001-4942（2015）10-0102-04

雪胆溶液是经提取雪胆制成的单味药制剂，其主要有效成分为雪胆甲素。雪胆提取物的检测很多采用高效液相一紫外光检测法，均为末端吸收法。在用高效液相一紫外检测法测定时，由于雪胆甲素只在紫外末端有吸收，若采用低波长（200～210nm）检测，则溶剂背景难以消除，难以得到理想的测定结果。而示差折光检测器和蒸发光散射检测器均能够避免紫外检测时末端吸收的缺陷。示差折光检测器是基于样品组分的折射率与流动相溶剂折射率有差异的原理。蒸发光散射检测器是基于把从色谱柱分离的组分雾化为小颗粒，在其穿过光束时导致光散射而被检测的原理。但是考虑到示差折光检测器对环境要求极为苛刻，而且灵敏度低，而利用蒸发光散射检测器可以利用黄芪甲苷分子量大、熔点较高的优点，有效避免因为末端吸收而带来的杂质峰干扰，是测定黄芪甲苷较理想的方法。为进一步提高检测的精确度，对雪胆甲素的含量采用HPLC法，用蒸发光散射检测器进行检测。

1材料与方法

1.1材料

雪胆：购自河北安国中药批发市场；雪胆甲素对照品：购自中国药品生物制品检定所，批号111518-200602；雪胆溶液：由山东德州神牛药业有限公司提供，样品批号为20120501、20120502、20120503。

1.2仪器与试药

岛津LC-10A高效液相色谱仪，ELSD-All-tech 2000蒸发光散射检测；色谱柱：C18，4.6mm×250mm，乙腈为色谱纯（迪马）；水为纯净水（娃哈哈）。

1.3HPLC-ELS检测法的色谱条件

参照有关文献[7～11]，选用C18柱（4.6mm×250mm），流动相为乙腈-水（40：60）；流速0.8mL/min；柱温为室温；检测器为Alltech 2000蒸发光散射检测器；检测温度100℃；ELSD载气为高纯氮气；载气压力为0.35MPa。

1.4试验用溶液制备

1.4.1样品溶液制备 方法（1）：精密量取雪胆溶液1mL置10mL量瓶中，加甲醇稀释并定容，再精密移取5mL置25mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，备用。方法（2）：精密量取雪胆溶液1mL置25mL量瓶中，加甲醇稀释并定容至刻度，摇匀，滤过，备用。采用上述色谱条件进行试验，记录峰面积，方法（1）得到的峰面积为222491，方法（2）得到的峰面积为616732，故取方法（2）制备样品溶液。

1.4.2对照品溶液制备 精密称取雪胆甲素对照品20.88mg置25mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，制成0.835mg/mL的溶液，摇匀，滤过，备用。

1.4.3空白对照溶液 甲醇溶液。

1.4.4对照药材溶液制备 称取1.0g雪胆药材，加90%乙醇50mL，超声提取30min，滤过，取滤液水浴蒸干，残渣加甲醇溶解移至25mL量瓶中，定容，摇匀，滤过，备用。

1.5检测方法检验

1.5.1专属性试验 取空白对照溶液、对照品溶液、对照药材溶液、样品溶液，按照色谱条件进行试验，记录色谱图。

1.5.2线性关系考察 精密量取上述对照品溶液2、3、4、6、10mL，加甲醇稀释至10mL，摇匀。分别精密量取上述溶液20μL注入高效液相色谱仪，测其峰面积积分值，以峰面积（A）的自然对数为纵坐标，进样量（C）的自然对数为横坐标，计算回归方程。

1.5.3精密度试验 取对照品溶液10μL，连续进样6次，测定峰面积积分值，求其自然对数、平均值和RSD。

1.5.4稳定性试验 取样品溶液，在0、2、4、8、12h分别进样，测定峰面积积分值，求其自然对数。

1.5.5重现性试验 重复上述操作，对批号为20120501的样品溶液各测定6份，取平均值。

1.5.6回收率试验 取批号为20120501的样品溶液0.5mL，共6份，分置25mL量瓶中。称取35.2mg雪胆甲素置50mL量瓶，加甲醇稀释至刻度，摇匀，再分别精密量取5mL添加至放有样品溶液的量瓶中。按1.3的色谱条件进行测定，计算回收率。

回收率=测得量-样品中含量/加入对照品的量×100%

1.5.7样品测定 按1.3的色谱条件对3批样品溶液进行测定，重复2次。

2结果与分析

2.1专属性

由图1可见，在样品溶液色谱图中，与对照品溶液和对照药材溶液相同保留时间处，有相同的色谱峰呈现；在空白对照溶液色谱图中，相同保留时间处无相同的色谱峰呈现，说明空白无干扰。

2.2线性关系

表1和图2结果表明，雪胆甲素进样量在3.34～16.70μg之间，进样量（C）的自然对数与峰面积积分值（A）的自然对数呈良好的线性关系。

2.3精密度

表2结果显示，ln（A）平均值为12.6889，RSD为0.023%，仪器精密度良好。endprint

2.4稳定性

表3结果显示，样品溶液在12h内稳定性良好。

2.5重现性

由表4可见，雪胆甲素平均含量为7.6726mg/mL，RSD=0.33%，表明该方法重现性良好。

2.6回收率

由表5可见，平均回收率为98.81%，RSD为0.92%，表明该方法回收率良好。

2.6样品测定结果

结合药典中含量规定及本品处方投料量，雪雪溶液每毫升含雪胆甲素（C₃₀H₄₂O₆）不得少于6.0mg。表6可见，3批样品测定结果均大于6.0mg/mL，说明该方法可行。

3讨论与结论

蒸发光散射检测器的响应不依赖样品的化学性质，任何挥发性低于流动相的样品均能被检测，且响应因子一致。本试验使用的Alltech 2000蒸发光散射检测器是低温型检测器，当漂移管的温度为40℃时可以把沸点为100℃的水完全雾化，能够把基线噪音控制在较低水平。本试验结果表明，以雪胆甲素为指标成分，测定雪胆溶液中雪胆甲素含量，重现性好，无杂质峰干扰，简便易行，准确可靠，因此可作为质量标准的控制指标。

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