响应面法优化枯草芽孢杆菌NS178产芽孢发酵工艺

王西祥+丁延芹+杜秉海+姚良同+祁国振+葛科+刘凯

摘要：应用单因素设计法对影响内生枯草芽孢杆菌NS178发酵液菌落数的因子进行筛选，得到3个主要影响因子，分别为葡萄糖、（NH4）2SO4、K2HPO4。采用Box-BehnkenDesign法对发酵培养基进行优化，通过响应面法分析获得最佳配方为葡萄糖2.29%、（NH4）2SO40.3%、K2HPO40.23%。对温度、初始pH值、装液量3组培养条件进行优化，最佳条件为33℃、pH7.6、50mL。在最佳配方和培养条件下，NS178发酵液菌溶数为34.50×108cfu/mL；培养72h时芽孢率达到75.8%；优化后比优化前发酵液抑菌圈直径增加67%。

关键词：枯草芽孢杆菌；芽孢；响应面；抑菌圈

中图分类号：S144文献标识号：A文章编号：1001-4942（2015）04-0059-07

微生物肥料又称菌肥或生物肥料，是一类以微生物生命活动及其代谢产物使农作物得到特定有益肥料效应的微生物活体制品[1]。微生物肥料在培肥地力，保护环境，抑制农作物对硝态氮、重金属、农约的吸收，净化和修复土壤，促进农作物秸秆和城市垃圾的腐熟利用以提高生物质利用率、降低农作物病害发生，以及提高农作物产品品质和食品安全等方面已表现出不可替代的作用[2]，符合环境保护、食品安全和人类健康的需要[5]。微生物肥料的施用能够调节土壤微生物生态，使其向着健康方向发展[4]，促进植株吸收营养元素，产生抗生素等多种物质抑制细菌或真菌性病害，诱导系统抗性间接促进植物生长，增强植物抗逆性，提高宿主的抗性和减缓pH值变化等能力[3]。

收稿日期：2014-12-18

基金项目：农业部公益性行业科研专项经费项目（200903018）

芽孢杆菌（Bacillussp.）在自然界广泛存在，其抑菌物质复杂多样，具有较广抑菌谱[6]。研究芽孢杆菌对植物病害的防治作用，对于开发微生物菌剂有着十分重要的意义。枯草芽孢杆菌（Bacillussubtillis）是目前研究最为热门的抑菌微生物，不仅在防治多种植物病害方面具有独特优势，而且还能促进作物生长、增加产量、增强植物抗逆性等，国内外均有产品登记注册[7，8]。B.subtilis168作为第一株全基因组测序完成的革兰氏阳性菌，具有生物安全性，为研究细胞分化的模式微生物[9]。枯草芽孢杆菌所产芽孢耐热、耐旱、抗紫外线和有机溶剂等，在工业机械化生产及高温干燥过程中，可以保让微生物菌剂的活性，提高其产品质量[10]。不同枯草芽孢杆菌在抑菌谱、抑菌效果及抑菌机制等方面有较大差异，因此筛选出存活率高、繁殖速度快且具有较强抗菌能力的枯草芽孢杆菌仍是目前研究的重点[11]。

生物菌剂的制备过程中存在发酵菌落数偏低、芽孢生成率较低的问题，且优化培养基组成是一个长期复杂的过程，涉及大量的数据分析处理。响应面法（responsesurfacemethodology，RSM）克服了传统的单因素试验次数多、试验周期长和结果不准确的缺点，已被成功应用于培养基和培养条件的优化[12]。本文采用单因素试验设计方法，对影响枯草芽孢杆菌NS178发酵液菌落数的相关组分进行初步优化，通过Box-Behnken（B-B）设计进一步优化了发酵配方，确定了最优培养条件，以期为枯草芽孢杆菌肥料的开发提供可靠的理论依据，为工业生产生物菌肥提供参考。

1材料与方法

1.1供试菌株

供试菌：枯草芽孢杆菌（Bacillussubtillis）NS178，由本实验室保存。

指示菌：生姜茎腐病原菌（Pythiumsp.），由本实验室分离保存。

1.2供试培养基

菌种活化培养基（LB培养基）：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠10g，琼脂20g，蒸馏水1000mL。

发酵基础培养基（豆芽汁培养基）：黄豆芽200g，蔗糖20g，蒸馏水1000mL。

抑菌物质生测培养基（PDA培养基）：马铃薯100g，蔗糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL。

1.3菌种种子液的制备

将斜面保存的供试菌NS178接种到LB平板上，37℃恒温箱培养24h。接种环挑取一环接种到装有液体LB培养基的试管中，37℃、180r/min摇床培养，分光光度计法测定不同时期菌液的OD600值，绘制标准曲线，由此确定适宜种龄进行后续试验。

1.4最优培养基影响因素的获取

选取碳源、无机氮源、无机盐共12个因素做单因素试验，每因素设计4个水平，详见表1。以豆芽汁培养基（黄豆芽100g，蔗糖20g，水1L）为对照。重复4个。菌种种子液的接种量为2%（体积比），31℃、180r/min摇床培养24h先确定最佳碳源及其水平，在此基础上，确定最佳无机氮源及水平，最后确定最佳无机盐及水平。单因素试验均用活菌计数法测定的菌落数为指标，确定最优培养基的影响因素。

1.5最佳培养基的确定

根据单因素试验的结果，Box-Behnken模型以葡萄糖（x1）、（NH4）2SO4（x2）和K2HPO4（x3）浓度为自变量，以菌落数为响应值，设计响应面试验拟合自变量与响应值之问的函数关系。按下面公式进行编码转换：

X1=（x1-2）/1；X2=（X2-0.3）/0.2；X3=（x3-0.2）/0.1式中：X1、X2、X3为不同试验因素的编号，见表2。

试验设计与数据分析均为Design-Expert7.0软件提供。

将初始培养基和预测的最佳培养基进行培养试验，验证模型的准确性和有效性，重复3次。

1.6培养条件的优化

在获得最佳培养基配方的基础上，对培养条件进行优化。试验设6组初始pH值：6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，进行初始pH值对菌落数的影响试验；在250mL三角瓶中分别加入50、75、100、150mL液体培养基，进行需氧量试验；将培养温度调节为28、31、33、35、37℃，进行培养温度对菌落数的影响试验。培养条件优化菌落数以活菌计数法测定。endprint

1.7最佳培养基和最佳培养条件下的培养

1.7.1菌落数的测定（活菌计数法）无菌条件下将发酵液稀释至10-6、10-7、10-8，吸取200μL于无菌平板中，每个梯度重复3次。倒置平板于37℃培养箱中培养，20h后取出计数。

1.7.2芽孢率的测定将菌液培养24h后，每隔12h测定一次芽孢数。芽孢率的测定方法为：80℃水浴加热15min后，用稀释涂布法检测芽孢生成量[13]。

1.7.3抑菌物质效价的测定指示菌菌悬液的制备：将活化的生姜茎腐病病原菌涂布于PDA平板上，28℃培养4d。刮取一环菌丝体置于5mL无菌水中，振荡均匀，制成菌悬液。

生测平板的制备：将5mLPDA培养基倒入培养皿中，凝固后，用镊子夹取一个牛津杯置于培养皿中央。PDA培养基冷却至50～60℃，加入1mL指示菌菌悬液，混匀后倒入培养皿上层，置28℃培养箱中培养4d。

效价的测定：采用牛津杯法[14]。发酵液10000r/min离心5min后，取上清液加入牛津杯中（50μL/孔），28℃培养4d，十字交叉法测量抑菌圈直径，根据抑菌圈直径计算其效价。

2结果与分析

2.1NS178生长曲线

根据不同时期测定的OD600值绘制生长曲线，如图1所示。接种时菌液OD600值为0.150；培养12h时OD600值为0.623；培养24h时OD600值为2.013，此段时间生物量快速增长，菌落数较12h时增加14倍，为对数期；24～36h时，菌落数保持不变，为稳定期。因此，选择对数中后期（即20h）的菌作为菌种，进行培养基组成的优化。

2.2最优培养基影响因素

根据单因素试验设计，活菌计数法测定菌落数，不同物质及其水平对应的结果见表3。筛选的最优影响因素是葡萄糖、（NH4）2SO4和K2HPO4。

2.3最佳培养基

根据Box-Behnkon试验设计原理，进行3因素3水平响应面分析试验，获得17个试验点的菌落数如表4。17个试验点可以分为2类：其一为析因点，自变量在X1、X2、X3组成的三维顶点，总计12个析因点；其二为零点，即区域中心点，中心点试验重复5次，用于估计试验误差。

用标准多项式回归方法拟合，获得响应值与自变量关系的二次多项式：

式（1）中：Y为预测响应值即发酵液菌落数，方差分析见表5。

由表5可知，所选模型的不同处理间差异极显著，说明回归方程描述应变量与自变量之间的线性关系显著，试验方法真实可靠。X1、X2、X3、X1X2、X1X3、X12、X22、X32的P值均小于0.05，说明这些因素对模型显著。失拟项0.56>0.05，失拟项差异不显著，说明该方程对试验拟合性较好，试验误差小。该模型的R2=0.9931，=0.9843，自变量和响应值之间线性关系达到显著水平，因此可以利用该回归方程确定最佳发酵条件[15]。

根据上述回归方程及回归模型方程分析表绘出双因子效应分析图和相应等高图（见图2、图3和图4），可知，当K2HPO4浓度不变时，菌落数随着葡萄糖和（NH4）2SO4浓度的增大呈现先增大后减小的趋势.且葡萄糖增加速度较快；当（NH4）2SO4浓度不变时，菌落数量随K2HPO4浓度的增大呈缓慢增加趋势，葡萄糖增加速度较快，且呈现先增加后降低的趋势；当葡萄糖浓度不变时，随着（NH4）2SO4和K2HPO4浓度的增高，菌落数呈现先增大后降低的趋势，过高浓度的（NH4）2SO4和K2HPO4均不利于菌体的生长。

将式（1）分别对各自量（X1、X2、X3）求一阶偏导数并均令其为0，即可得到一个三元一次线性方程组，解此方程组得到模型预测最佳点为：葡萄糖2.29%、（NH4）2SO40.3%、K2HPO40.23%，代入回归方程，得到理论菌落数Y=32.50×108cfu/mL。

2.4模型的验证结果

由6可知，验证平均值与预测值相吻合，证实了模型的准确性。响应面法获得最佳培养条件是可行的，菌落数可以真实反映3个影响因素对菌落数的影响。优化后发酵液菌落数为33.12×108cfu/mL，较优化前提高5.83倍。

根据《中华人民共和国农业行业标准—微生物肥料》（NY227-94）的规定，用于微生物肥料的液体成品指标中，有效活菌落数为5×108～10×108cfu/mL，杂菌落数<5%。优化后发酵液菌落数满是微生物肥料的要求，适用于有益微生物制成的、能改善作物营养条件的活体微生物肥料制品。

2.5最佳培养条件

测定6个初始pH值对菌落数的影响（图5），发酵培养基初始pH值为6.0～7.5时与菌落数呈正相关，7.5～8.5时呈负相关；枯草芽孢杆菌NS178的最适宜初始pH值为7.5，细菌总数为31×108cfu/mL。过高或过低都不利于菌体增殖，

250mL三角瓶的装液量为50、75、100、150mL所得活菌落数如图6所示，菌落数随着装液量的增加而逐渐减少，以每瓶装液量50mL产量最高，说明该菌株为好氧菌，发酵过程中要求较好的通气条件。虽然没有设置装液量低于50mL试验，但是250mL三角瓶内装液量过少可能由于过度蒸发而改变培养基各组分的浓度，产生较大的试验偏差，也会因发酵液体积过少而导致发酵规模的缩小，实际意义不大，因此选择50mL作为最佳装液量，此时菌落数为33×108cfu/mL。

图7显示，33℃以下温度不利于菌体增殖，当温度为33℃，菌落数达到最大值，为34.5×108cfu/mL，此后随温度升高呈下降趋势。

2.6最佳培养基和培养条件对茵落数和芽孢率的影响

优化培养条件后，24h菌落数为34.50×108cfu/mL，为优化前近7倍；72h时芽孢数为26.75×108cfu/mL，芽孢率达到75.8%，结果如图8。endprint

2.7最佳培养基和培养条件下发酵液的抑菌效果

优化前发酵液的抑菌圈直径为12.56mm，优化后发酵液的抑菌圈直径为20.93mm。优化后较优化前增加67%，优化后的发酵液能产生更多抑菌物质，拮抗效果如图9所示。

3讨论

本试验采用单因素试验设计从影响菌落数的12个因素中，确定葡萄糖、（NH4）2SO4、K2HPO4为最重要的影响因素。为了合理简便地寻找响应面试验中心点，进一步采用Box-BehnkenDesign响应面法分析，得出回归模型最优组合为葡萄糖2.29%、（NH4）2SO40.3%、K2HPO40.23%。模型预测的最大菌体浓度为32.50×108cfu/mL，验证值为33.12×108cfu/mL，与预测值相差1.91%。实测值和预测值之间较好的吻合性显示了所建模型的精确性和可靠性。

本试验还通过摇瓶发酵研究了初始pH值、溶氧水平以及温度对枯草芽孢杆菌菌落数形成的影响。初始pH值对菌落数的生成有很大影响，在初始pH为7.5时，菌落数最多，过酸或过碱都不利于菌落形成。溶氧水平试验中，菌落数随着装液量增加而降低，最佳装液量为50mL，随着液体体积的增加，细菌供氧不足，不利于好氧菌株NS178菌落数的增加。赵达等[16]利用单因素筛选和均匀设计试验对枯草芽孢杆菌B03液体发酵条件为：500mL三角瓶装液量50mL，初始pH值6.0，发酵温度35℃，摇床转速180r/min，发酵周期60～66h，与本试验结论基本相符。

芽孢并不是细菌生活史中不可缺少的部分，只是产芽孢细菌在生长过程中形成的一种抗逆性休眠体，它的形成受很多因素的影响，包括营养物质、环境因素等[18]。芽孢形成是一个受基因控制的极其复杂的过程，已发现枯草芽孢杆菌至少有50个基因与芽孢形成有关，大致分布在染色体的5个区段中，按照一定的方向和顺序表达，分别控制芽孢形成过程的不同阶段。2，6-吡啶二羟酸（DPA）是芽孢的特有成分，在母细胞中与Ca2+结合形成Ca2+-DPA复合物，在降低芽孢核含水量和增强芽孢耐热性上起着重要作用[19]。豆芽汁培养基可以为芽孢的形成提供大量的Ca2+，促进芽孢形成。K+能促进B.megaterium、B.cereus形成芽孢[20]。从表7的对比结果可知，本试验获得的芽孢数、芽孢生成率和容积生产率明显高于国内外水平。

在同一培养基中，菌株生长量与其抑菌物质分泌呈正相关，菌株抑菌物质是在菌株生长过程中分泌的代谢产物，内生拮抗细菌BS-2对植物病害的防治作用是由菌体在植物体内的内生定殖和分泌抑菌物质共同作用的结果[2]。生防菌分泌的抑菌物质种类多样，浓度高低和代谢条件也不尽相同。刘雪等[2]研究发现抑菌物质为蛋白质，可以抑制病原菌菌丝生长和孢子萌发，并使部分孢子萌发畸形。卢彩鸽等[23]发现利迪链霉菌A01活性代谢产物那他霉素对甘蓝枯萎病菌丝生长和分生孢子萌发均有明显的抑制活性，通过增加膜的通透性引起菌丝细胞的形态和内部结构的病变。

本试验对枯草芽孢杆菌NS178的培养基及培养条件进行了摇瓶发酵的初步探究。为了获得更多可靠的数据，需要进一步研究NS178对指示菌的拮抗机制，并研究发酵罐中芽孢形成的最适宜条件，为大型工业发酵生产提供参考。endprint