去甲斑蟊素对U87MG细胞增殖的影响

刘柏林 刘斌223300江苏护理职业学院

去甲斑蟊素对U87MG细胞增殖的影响

刘柏林 刘斌
223300江苏护理职业学院

目的：探讨去甲斑蟊素对神经胶质瘤U 87MG细胞生物学行为的影响。方法：用MTT法检测不同浓度的去甲斑蟊素对U 87MG细胞增殖的抑制作用。用ELISA实验检测血管内皮生长因子(VEGF)蛋白的表达水平。结果：MTT结果表明去甲斑蟊素对U87MG细胞的增殖有抑制作用，并随浓度增加抑制作用增强；ELISA实验提示去甲斑蟊素抑制U 87MG细胞分泌VEGF蛋白。结论：去甲斑蟊素可以抑制U 87MG细胞增殖，抑制肿瘤新生血管的形成。

神经胶质瘤；U 87MG；去甲斑蝥素；血管内皮生长因子

恶性胶质瘤是成人中枢神经系统最常见的原发性肿瘤，目前主要的治疗方法是手术切除后辅助放疗和化疗[1]。近年来尽管其诊断技术不断提高，治疗方案不断改进，但预后较差。因为胶质瘤呈现浸润性生长，彻底切除将引起大脑严重损伤。因此，迫切需要新的治疗方法，提高生存率。近期我们用去甲斑蝥素作用体外培养的人神经胶质瘤U87MG细胞系，研究其在神经胶质瘤中的治疗作用。

资料与方法

实验材料：人神经胶质瘤U87MG细胞系购自美国 American Type Culture Collection公司(USA)。U87MG生长在含有10％胎牛血清(FBS)和P/S溶液(10 000 U/ mL青霉素，10 000μg/mL链霉素)的DMEM培养基中。并在37℃、5％CO2、饱和湿度细胞培养箱培养。

药品与试剂：去甲斑蝥素购自Sigma公司(St Louis，MO，USA)，溶解在二甲亚砜(DMSO)中使用。MTT购于Serva公司，用PBS配置成5mg/mL使用浓度，避光保存。DMEM培养基、二甲基亚砜(DMSO)、胎牛血清购于美国Gibico公司。VEGFELISA试剂盒购于德国IBL公司。

方法：①MTT法测定去甲斑蝥素对U87MG细胞增殖的影响：U87MG细胞接种于96孔板，接种密度5 000～6 000细胞/孔，约100μL，设置3个复孔；在37℃、5％CO2、饱和湿度细胞培养箱孵育24h后开始加入不同浓度的斑蝥素，空白对照组添加同等量的DMEM培养液，溶剂对照组添加同等量的1％ DMSO。继续培养24h后，每孔加入10μLMTT(10mg/mL)试剂溶液，5％CO2，37℃温育4h后，去掉孔内培养液，每孔加入200μL的DMSO液体，震荡，用酶标仪测570nm波长处每孔的吸光度(A)值，结果重复3次。细胞增殖抑制率=[(对照组A值-处理组A值)/对照组A值]× 100％。②ELISA法测定去甲斑蝥素对U87MG细胞分泌VEGF的影响：根据MTT结果，实验分组：空白对照组，12μmol/L斑蝥素组，96μmol/L斑蝥素组。将细胞接种在6孔板内，37℃温箱培养，24h后，添加12μmol/L，96μmol/L去甲斑蝥素到相应孔中，空白对照添加同体积培养液体。继续37℃温箱培养24h，收集细胞上清于离心管，400g离心5min，吸去上清，保存于-80℃，备用。待上机检测时取出。设立样品对照，检测样品和标准品孔，然后分别将样品对照品、检测样品和稀释好的标准品100μL加入到相应的微孔中，37℃下孵育1h。吸出液体，然后洗涤。每孔加100μL酶标抗体(试剂空白对照孔外)，4℃下温育0.5h，洗板9次。加底物显色液100μL，37℃，避光，孵育0.5h。于各反应孔中加入2M硫酸50μL。在ELISA检测仪上，检测OD450值。

统计学分析：采用SPAS 16.0 for windows软件包进行统计分析。各组之间的数据比较采用单因素重复测量资料的方差分析，所检测数据用用(x±s)表示，检验水准α=0.05，当P＜0.05认为差异有统计学意义。

结果

MTT法测定斑蝥素作用24h后对U87MG细胞增殖的影响：分别用3～384 μmol/L浓度的去甲斑蝥素作用于U87MG细胞，24h后，MTT法测得去甲斑蟊素对U87MG细胞有明显增殖抑制作用，而且随去甲斑蟊素浓度升高，抑制率也相应增加，呈明显的剂量效应关系，P＜0.05，见表1。

ELISA 法测定去甲斑蝥素对VEGF 的影响：ELISA 实验提示空白组细胞VEGF 表达量明显低于12μmol/L和96μmol/L斑蝥素组， 差异有统计学意义(P＜0.05)，实验结果表明，斑蝥素能够抑制U87MG 细胞分泌VEGF。

讨论

现在研究表明斑蝥可以抗肿瘤，对肝癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌等多种肿瘤有治疗作用。对其进一步研究，发现其还具有免疫抑制及升高白细胞的作用[2-3]。对于斑蝥抗肿瘤的机制，多名学者进行了深入研究。张卫东等研究发现[3]，斑蝥素可通过MAPK信号传导途径，降低ERK及phos-ERK的表达，使A549细胞增殖受到抑制。何太平等研究发现[4]，斑蝥素可能通过转化生长因子β(TGF-β)信号传导通路，磷酸化激活Smad后，Smad3与Smad4复合物与SBE结合，启动相关靶基因的表达，从而抑制肿瘤的发生与发展。进一步研究发现斑蝥能有诱导细胞凋亡的细胞作用。另有研究斑蝥可以抑制肿瘤新生血管的生长。Lee YC等研究表明[5]，去甲斑蝥素通过阻断VEGFR2/MEK/ERK信号通路，抑制VEGF的分泌，进而使肿瘤新生血管形成减少，其迁移、侵袭能力明显下降。吴秋玲等也研究表明斑蝥可以降低MMP-9及VEGF的表达[6]，通过抑制肿瘤新生血管的生长，来抑制肿瘤生长。

笔者的研究中，ELISA实验提示空白组细胞VEGF表达量明显低于12μ mol/L和96μmol/L斑蝥素组，表明去甲斑蝥素能够抑制U87MG细胞分泌VEGF。VEGF促进肿瘤新生血管形成，当VEGF分泌下降时，肿瘤新生血管形成减少，U87MG细胞迁移，侵袭力必然降低。MTT结果显示，去甲斑蝥素处理组细胞吸光度值与空白组相比，出现了明显的生长抑制现象，差异有统计学意义(P＜0.05)。上述结果与斑蝥素在其他肿瘤研究中的研究结果相一致。这些现象说明斑蝥素能有效抑制U87MG细胞的增殖能力，降低其产生肿瘤新生血管的能力，其具体作用机制还需要进一步研究。

综上所述，斑蝥能明显抑制U87MG细胞的增殖能力，降低其产生肿瘤新生血管的能力，对神经胶质瘤有一定治疗作用，对其进一步研究，可为神经胶质瘤治疗提供新的方法。

[1] Mannas JP，Lightner DD，Defrates SR，et al. Long-term treatment with temozolomide in malignant glioma[J].JClin Neurosci，2014，21 (1)：121-123.

[2]李森林，肖文海，黄岩.斑蝥的现代药理研究和临床应用[J].社区用药指导，2007，9(109)：16.

[3] 张卫东，赵惠儒，宗志红，等.斑蝥素通过MAPK信号传导途径对A549细胞增殖抑制作用的研究[J].肿瘤防治杂志，2004，11 (11)：1151-1153.

[4] 杨寰，强亚杰.斑蝥复方药酒提物对小鼠肝癌H-22的治疗作用研究[J].河南大学学报：医学版，2013，32(4)：258-261.

[5] Lee YC，Lee LM，Yang CH，et al.Norcantharidin inhibits tumor angiogenesis via blocking VEGFR2/MEK/ERK signaling pathways[J]. Cancer Sci，2013，104(5)：604-610.

[6] 吴秋玲，卢宏达，郭继龙，等.水蛭斑蝥对小鼠移植肉瘤血管形成的影响[J].中国中医基础医学杂志，2012，18(6)：667-669.

Effectof norcantharidin on U87MG cellproliferation

Liu Bailin，Liu Bin
Jiangsu Nursing CareerAcademy223300

Objective：To explore the effect of norcantharidin on neuroglioma U87MG cell biological behaviour.Methods：The inhibition effects of different concentrations of norcantharidin on U87MG cell proliferation were detected by MTTmethod.The expression levelofvascular endothelialgrowth factor(VEGF)proteinwas detected by ELISA test.Results：MTT results showed that norcantharidin had inhibition effect on U87MG cell proliferation，and the inhibition effect increased with the increasing concentration.ELISA test showed that norcantharidin inhibited U87MG cell secretory VEGF protein.Conclusion：Norcantharidin can inhibitU87MG cellproliferation，inhibit the formation of tumorangiogenesis.

Neuroglioma；U87MG；Norcantharidin；Vascularendothelialgrowth factor

表1 MTT检测去甲斑蟊素对U87MG细胞增殖抑制的作用(x±s)

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10.3969/j.issn.1007-614x.2015.22.1