脑创伤模型大鼠脑组织中SBDP145和SBDP120的水平测定

黄 锐

湖北襄阳市中医院神经外科 襄阳 441000

脑创伤模型大鼠脑组织中SBDP145和SBDP120的水平测定

黄 锐

湖北襄阳市中医院神经外科 襄阳 441000

目的 检测大鼠重型颅脑损伤模型脑组织中SBDP140和SBDP120浓度，分析其在创伤急性期释放趋势。方法

创伤性脑损伤；SBDPS

αII-spectrin大量存在于在神经元的轴突和突触前末梢，能够被calpain分解为SBDP150和SBDP145，被caspase-3分解为SBDP120。由于calpain和caspase-3是脑缺血和脑损伤发生时促进细胞凋亡坏死的重要因子［1］，因此SBDPS（αII-spectrin break down Products）可能与颅脑损伤造成的脑细胞损害存在着联系，可以成为一种脑损伤的标志物。本研究检测了大鼠重型颅脑损伤CSF中SBDP145和SBDP120浓度，分析其在创伤急性期释放趋势。

1 资料和方法

1.1 实验动物及分组 健康成年雄性SD大鼠70只（湖北省实验动物中心提供），体质量250～300g，随机分为对照组（假手术组）10只，实验组（重型脑损伤组）60只。

1.2 大鼠脑挫裂伤模型制作方法 以氯胺酮按照60mg/kg腹腔内注射麻醉大鼠后，大鼠脑立体定位仪固定大鼠头部，剪去顶部皮毛，消毒皮肤后，正中切开顶部头皮，剥离骨膜显露左顶骨，于中线左侧旁开约3mm，前囱后约2mm处用开直径5mm圆形骨窗，保持硬膜完整。采用自由落体打击装置，以40g砝码于25cm高处通过金属导杆落下，撞击置于硬脑膜上的圆锥上致重型脑挫裂伤，骨蜡封闭骨窗，缝合头皮。

1.3 标本制备 分别于模型制作成功后6h、12h、24h、48 h、72h、120h迅速断头处死小鼠，各时间点处死10只，制备脑组织匀浆，取挫伤的大脑组织（去除小脑和延髓部分），称重后移入玻璃匀浆管中，加入9倍体积的预冷生理盐水，4℃条件下充分研碎匀浆，制备10％匀浆，离心机4 000rpm离心10min，取上清液，-80℃冻储存。

1.4 检测方法 所有标本均采用酶联免疫吸附剂测定分析方法ELSISA的方法进行检测，用抗大鼠SBDP145、SBDP120单抗分别包被于酶标板上，标准品和样品中的SBDP145、SBDP120与单抗结合，加入生物素化的抗人SBDP145、SBDP120形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合，加入底物工作液显蓝色，最后加终止液，在450nm处测OD值，SBDP145、SBDP120浓度与OD值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中SBDP145、SBDP120浓度。

1.5 统计学分析 所有数据分析均使用SPSS 17.0，计量资料以均数±标准差表示，比较Mann-Whitney检验，2组或3组间的数值比较采用Kruskal-Wallis检验，P＜0.05差异有统计学意义。

2 结果

本次研究共包括60只重型颅脑损伤大鼠模型作为实验组，10只假手术模型作为对照组，实验组所有患者SBDP145 和SBDP120的平均浓度明显高于对照组（P＜0.05）（表1）。SBDP145的释放方式明显不同于SBDP120，SBDP145在伤后6h就能够检测到明显的变化，而SBDP120在伤后在其变化不明显，直到到伤后72h达到峰值（图1）。

表1 实验组各时间点和对照组SBDP145和SBDP120的浓度比较（ng/mL）

图1 实验组各时间点和对照组SBDP145 和SBDP120的浓度曲线

3 讨论

目前，在创伤性脑损伤发生早期对创伤的严重性和预后进行预测，仍没有十分确切的办法，临床中经常应用的一些措施如GCS评分等，虽然应用多年，且经过很多临床试验的研究检验，但仍有一些局限性。近年来，几种胶质细胞或神经元合成的蛋白被认为可以作为中枢神经细胞损伤的标记物，但没有临床应用的充分证据，这些标志物如NSE、S100、UCH-L1等，NSE被认为可以用来评估脑细胞的损害，但代谢时间较长，难以评估原发性损伤的程度，且难以区分原发性和继发性损伤，且受到血细胞溶血的影响。S100研究较充分，并且与GCS评分和神经影像学表现相关性较高，然而其特异性不高，当其他部位出现损伤时其表达仍然增多［2］。最近的研究表明UCH-L1在重型颅脑损伤患者的CSF中浓度明显增高，而且与脑损伤程度GCS、CT、6周内的致死率有相关［3］。

许多研究者认为出现创伤性脑损伤时，SBDPS可以作为一种潜在的标志物，Brophy等人［6］进行了脑脊液的动力学分析，认为在创伤性脑损伤急性期与caspase-3相比calpain介导的细胞凋亡可能起更重要的作用。因此SBDPS不仅在脑损伤程度方面能够提供重要的信息，而且能够解释脑细胞凋亡坏死相关的病理损伤机制，本次研究通过ELISA的方法进一步证实在创伤性脑损伤的病理变化过程中，calpain和caspase-3介导的蛋白水解作用其重要的作用，而且SBDPS表现的表达水平持续的增高的现象对脑损伤的程度的评估有很大的帮助。Farkas等人的研究中［4］，发现脑脊液中的SBDPS的浓度在脑外伤患者中明显高于对照组，Pineda等［1］的研究也发现在脑脊液中SBDP145的释放形式不同于SBDP120，在我们的研究中，SBDP145的最大峰值出现在伤后6 h，而持续时间长，降低缓慢，直到伤后5d，而SBDP120则在伤后的浓度变化较慢，在伤后3d到达峰值，这种现象意味着，在伤后5d内细胞凋亡和坏死的机制以不同的形式被激活。αII-spectrin大量存在于轴突和突触前末梢，而轴突是容易受到机械性损伤的影响，McCracken等的研究表明［5］，在创伤性脑损伤的患者中，伤后轴突的迟发性损害可能是由于蛋白水解酶介导的细胞结构的破坏，尽管一定数量的轴索在创伤发生时已经断离（原发性损伤），但更多的损伤是有继发性损害造成的，而且是不可逆的。另外的一些学者认为，这种轴突神经传导作用的改变能够导至一些酶类如calpain和caspase-3的释放，而这种改变进一步促进轴突细胞结构的破坏［6］，因此SBDPS也许能够作为一种轴突损害程度的标志物。总之，脑组织中的SBDPS与创伤性脑损伤后有明显的变化，随着研究的不断深入，SBDPS可能成为一种对创伤性脑损伤有临床应用价值的标志物。

［1］Pineda JA，Lewis SB，Valadka，et al.Clinical significance of alphaII-spectrin break down products in cerebrospinal fluid after severe traumatic brain injury［J］.J Neurotrauma，2007，24（3）：354-366.

［2］Papa L，Robinson G，Oli M，et al.Use of biomarkers for diagnosis and management of traumatic brain injury［J］.Expert Opin Med Diagn，2008，28（7）：1-9.

［3］Papa L，Akinyi，Liu MC，et al.Ubiquitin C-terminal hydrolase is a novel biomarker in humans for severe traumatic brain injury ［J］.Crit Care Med，2009，38（12）：138-144.

［4］Farkas O，Polgar B，Szekeres-Bartho，et al.Spectrin break down products in the cerebrospinal fluid in severe head injury-preliminary observations［J］.Acta Neurochir Wien，2005，1 478（4）：855-861.

［5］McCracken E，Hunter AJ，Patel S，et al.Calpain activation and cytoskeletal protein break down in the corpus callosum of headinjured patients［J］.J Neurotrauma，1999，169（3）：749-761.

［6］Povlishock JT，Christman CWJ.The pathobiology of traumatically induced axonal injury in animals and humans：a review of current thoughts［J］.Neurotrauma，1995，124（9）：555-564.

（收稿2014-07-23）

R-332

B

1673-5110（2015）10-0068-02

随机将70只成年雄性SD大鼠分为对照组（假手术组）10只，重型脑损伤组60只，于模型制作成功后处死小鼠，制备脑组织匀浆，所有标本均采用酶联免疫吸附剂测定分析方法进行检测SBDPS的浓度。结果 SBDP145和SBDP120浓度，在不同的时间点上实验组明显高于对照组，SBDP145在伤后6h就能够检测到明显变化，而SBDP120直到到伤后72h才有明显的升高。结论 创伤性脑损伤脑组织中的SBDPS与脑损伤的严重性有关。