cyclin D1表达对cN2口腔鳞癌患者TPF诱导化疗的预测性研究*

孙文文 唐晓 朱东旺 马捷 马海龙 刘莹 谈亦然涂瑶瑶 王丽珍 李江 钟来平 张陈平 张志愿

·临床研究与应用·

cyclin D1表达对cN2口腔鳞癌患者TPF诱导化疗的预测性研究*

孙文文①唐晓①朱东旺①马捷①马海龙①刘莹①谈亦然①涂瑶瑶①王丽珍②李江②钟来平①张陈平①张志愿①

目的：探讨cyclin D1在局部晚期口腔鳞癌患者中预后价值以及能否作为多西他赛联合顺铂、5-氟尿嘧啶（TPF）诱导化疗的预测生物标志物。方法：2008年3月至2010年12月上海交通大学医学院附属第九人民医院局部晚期口腔鳞状细胞癌患者256例行TPF诱导化疗的前瞻性随机临床试验为研究对象。随机分为试验组（术前TPF诱导化疗+手术+术后放疗）和对照组（手术+术后放疗）。采用免疫组织化学法检测患者活检标本中cyclin D1蛋白的表达情况，分析cyclin D1表达与行TPF诱导化疗患者预后的关系。结果：256例患者中232例符合cyclin D1检测条件，其中cyclin D1低表达者比高表达者有较高的总生存率（P= 0.001）、无病生存率（P=0.003）、无局部复发生存率（P=0.004）和无远处转移生存率（P=0.001）。试验组和对照组之间的患者预后无差异，cyclin D1表达水平与患者行TPF诱导化疗后的疗效无显著相关性，但cN2患者中cyclin D1高表达者可从TPF诱导化疗在总生存率（P=0.024）和无远处转移生存率（P=0.024）中获益。结论：cyclin D1可作为局部晚期口腔鳞癌患者的预后生物标志物，cyclin D1高表达的cN2口腔鳞癌患者可从TPF诱导化疗中获益。

口腔鳞状细胞癌 cyclin D1 诱导化疗 生物标志物

口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤，预后较差，5年生存率仅50%～60%［1-2］，而临床晚期患者5年生存率更低［3］。目前局部可切除的晚期口腔鳞状细胞癌患者主要是以根治性手术为主的综合治疗。诱导化疗（induction chemotherapy）的主要目的是缩小肿瘤的局部范围或降低肿瘤的恶性程度，从而最大程度保存正常组织器官、降低肿瘤局部复发或者远处转移的风险，提高患者的治疗效果［4］。本课题组前期完成了一项探讨TPF诱导化疗在局部晚期可切除的口腔鳞癌患者的效果的前瞻性随机临床对照试验［5］。虽然临床结果表明多西他赛联合顺铂、5-氟尿嘧啶（TPF）诱导化疗不能整体提高口腔鳞状细胞癌患者的生存率，但为开展生物标志物的临床研究提供了良好的机会。

cyclin D1基因是位于11q13染色体上的原癌基因，通过编码核蛋白cyclin D1，促进细胞进入细胞周期［6］。以往研究均发现cyclin D1在OSCC患者中高表达，但cyclin D1高表达在口腔鳞癌患者的预后中的预测价值仍存在争议［7-9］。本研究旨在探讨cyclin D1在局部晚期口腔鳞癌患者中的预后价值，以及与TPF诱导化疗的关系。

1 材料与方法

1.1 资料

患者256例来自上海交通大学医学院附属第九人民医院的一项前瞻性随机对照Ⅲ期临床试验（注册号NCT01542931），其目的在于探讨局部晚期口腔鳞癌术前TPF诱导化疗方案能否延长患者的生存期。纳入标准：临床Ⅲ/ⅣA期的原发性可切除口腔鳞癌患者，KSP评分＞60，无血液系统、肝脏和肾脏的功能障碍。符合标准的患者随机分为试验组（术前TPF诱导化疗+手术+术后放疗）和对照组（手术+术后放疗）。TPF诱导化疗方案：第1天静脉滴注多西他赛75 mg/m2，顺铂75 mg/m2，连续5天静脉滴注5-氟尿嘧啶750 mg/m2，3个星期为1个疗程，共2个疗程。诱导化疗结束后至少2周行局部的根治性手术，术后4～6周行放疗，1.8～2.0 Gy/次，每周5次，共行6周，总放射剂量为54～60 Gy，对具有高危因素的患者，推荐总剂量可达66 Gy。患者治疗后2年内随访1次/3个月，第3～5年随访1次/半年，5年后随访1次/年。本研究符合本院伦理委员会要求。

1.2 免疫组织化学染色检测cyclin D1表达

收集入组患者活检石蜡标本，检测cyclin D1表达水平，若对照组活检标本缺失，则使用手术切除的组织标本替代。免疫组织化学法采用如下常规操作：标本切片厚度为4 μm，于载玻片上经二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化去除内源性过氧化物酶，在0.01 M（pH=6.0）柠檬酸钠缓冲液中煮沸20 min，室温下冷却，使用PBS洗涤3次，每次5 min，一抗采用兔源cyclin D1单克隆抗体（购自美国Epitomics公司）按1:150稀释后4℃下孵育过夜，室温放置1 h后使用PBS洗涤3次，每次5 min。采用鼠抗兔二抗和DAB试剂盒显影。PBS替代一抗作为阴性对照。染色结果由2位病理科医生独立评价，cyclin D1为细胞核染色。按照阳性细胞占肿瘤细胞的比例进行评分：阳性细胞≤10%为阴性，阳性细胞＜50%为弱阳性，阳性细胞≥50%为强阳性。染色结果强阳性定义为cyclin D1高表达，弱阳性和阴性定义为cyclin D1低表达。1.3 统计学分析

采用SPSS 13.0软件包进行统计学分析。生存分析采用Kaplan-Meier方法和Log rank检验。患者生存时间从患者入组开始计算，总生存率（overall sur⁃vival，OS）为患者任何原因的死亡，无病生存率（dis⁃ease free survival，DFS）为患者肿瘤复发或任何原因的死亡，无局部复发生存率（locoregional recurrence free survival，LRFS）为肿瘤局部或颈部复发或任何原因的死亡，无远处转移生存率（distant metastasis free survival，DMFS）为肿瘤远处转移或任何原因的死亡。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 局部晚期口腔鳞癌患者cyclin D1表达水平与基线特征的关系

256例患者中24例因活检或手术标本无法获取，最终232例用于cyclin D1分析，其中对照组127例、试验组105例。中位随访时间为60个月，所有患者的基线资料和cyclin D1在活检肿瘤组织中表达水平见表1，cyclin D1低表达155例（对照组84例、试验组71例），其中阴性37例（对照组19例、试验组18例）、弱阳性118例（对照组65例、试验组53例）。cyclin D1高表达77例（对照组43例、试验组34例）。cyclin D1表达水平在试验组和对照组中无显著性差异（χ2=0.215，P=0.898）。cyclin D1表达水平与患者的年龄、性别、临床分期、病理分级等均无显著性差异。经5年随访，试验组和对照组的患者OS（P=0.354）、DFS（P=0.162）、LRFS（P=0.392）或DMFS（P=0.207）均无显著性差异。

表1 局部晚期口腔鳞患者的基线资料和活检组织中cyclin D1表达情况Table 1 Baseline characteristics of patients with locally advanced oral squamous cell carcinoma and cyclin D1 expression

2.2 cyclin D1表达水平与患者预后的关系

232例患者活检组织中cyclin D1表达水平与预后显著相关，cyclin D1低表达的患者与高表达的患者相比其OS（P=0.001）、DFS（P=0.003）、LRFS（P=0.004）和DMFS（P=0.001）具有显著性差异（图1）。

2.3 cyclin D1表达水平与TPF诱导化疗的预后关系

依据RECIST1.0标准评估试验组105例患者的短期临床疗效，78.1%（82/105）患者临床有效（4例完全缓解、78例部分缓解），18.1%（19/105）患者无临床疗效（18例稳定、1例进展），4例患者的临床疗效无法评估。cyclin D1表达水平与TPF诱导化疗后临床疗效无明显相关性（χ2=2.297，P=0.130）。

2.4 cN2患者cyclin D1表达与TPF诱导化疗的预后关系

通过对各个亚组分析，发现在临床颈淋巴结cN2期的患者中，cyclin D1高表达患者在OS（图2A）和DMFS（图2B）上可从TPF诱导化疗中显著获益，而cyclin D1低表达不能显著获益（图2C，2D）。表明cy⁃clin D1高表达的cN2口腔鳞癌患者可从TPF诱导化疗中显著获益。

图1 cyclin D1表达与局部晚期口腔鳞癌患者的预后关系Figure 1 The survival analysis of patients with oral squamous cell carcinoma according to the expression of cyclin D1

图2 cN2口腔鳞癌患者中cyclin D1不同表达水平与TPF诱导化疗的预后关系Figure 2 Survival analysis in cN2patients with oral squamous cell carcinoma based on cyclin D1 expression

3 讨论

cyclin D1在G1期与CK4/CK6形成复合物，通过Rb蛋白的磷酸化驱使细胞由G1期进入S期［6］，从而促进细胞增殖。研究发现，在口腔鳞癌中cyclin D1过表达和cyclin D1基因扩增与口腔鳞癌患者的预后不良有关［10］。但也有研究表明cyclin D1基因扩增与口腔鳞癌患者的预后无显著相关［11］。其原因可能是cy⁃clin D1的表达上调是通过一定的分子机制增加其翻译或者受损蛋白的降解，而不是通过cyclin D1基因的扩增变异调节［12］。同时也有研究表明cyclin D1的表达和口腔鳞癌患者的预后无明显相关性［8］。在对cyclin D1表达的研究基础上，将cyclin D1蛋白的表达水平作为一种潜在的预测患者预后的分子标志物。本研究将cyclin D1作为潜在的生物标志物探索局部晚期口腔鳞癌患者能否从TPF诱导化疗中获益，发现患者在cyclin D1低表达中治疗效果明显好于cyclin D1高表达，同时cyclin D1高表达的cN2患者可从TPF诱导化疗中获益，说明cyclin D1不仅可以作为口腔鳞癌的预后生物标志物，也可以作为cN2患者接受TPF诱导化疗的预测性生物标志物。

本研究在对试验组的患者行化疗疗效分析中，发现cyclin D1蛋白作为生物标志物预测患者的化疗疗效时具有一定的局限性。通过亚组分析，发现cN2期患者中cyclin D1高表达的患者接受TPF诱导化疗后有较高的总生存率和无远处转移生存率，而cyclin D1低表达的患者不能从TPF诱导化疗中获益。当然，这一结果还需要新的临床试验加以验证。可利用cyclin D1作为一项活检病理指标在cN2口腔鳞癌患者中行手术前筛查，对于cyclin D1高表达的患者行TPF诱导化疗的临床试验，而对于cyclin D1低表达的患者建议直接手术和术后放射治疗，以期整体提高患者的疗效，同时降低医疗成本。

根据多项头颈鳞癌患者的诱导化疗Meta分析发现，诱导化疗能明显降低患者的5年远处转移率，降低远处转移的风险［13-15］。本课题组前期的口腔鳞癌TPF诱导化疗临床试验发现，诱导化疗降低远处转移率的效果不是很显著［16］，但如结合cyclin D1作为预测性生物标志物，cN2口腔鳞癌患者可以从TPF诱导化疗中显著获益，无远处转移生存率较对照组显著提高。因此，对于cN2期口腔鳞癌患者，采用生物标志物筛选，对提高疗效具有十分重要的意义。

综上所述，cyclin D1高表达可以作为预测局部晚期口腔鳞癌患者的预后不良生物标志物，同时也可以作为cN2患者接受TPF诱导化疗的预测性生物标志物。

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（2015-06-19收稿）

（2015-08-18修回）

钟来平 专业方向为口腔颌面部肿瘤的临床与基础研究。

E-mail：zhonglaiping@163.com

“国家基金研究进展综述”栏目介绍

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——《中国肿瘤临床》编辑部

Cyclin D1 as a potential predictive biomarker for TPF induction chemotherapy in cN2patients with oral squamous cell carcinoma

Wenwen SUN1,Xiao TANG1,Dongwang ZHU1,Jie MA1,Hailong MA1,Ying LIU1,Yiran TAN1,Yaoyao TU1,Lizhen WANG2,Jiang LI2,Laiping ZHONG1,Chenping ZHANG1,Zhiyuan ZHANG1

1Department of Oral Maxillofacial and Head and Neck Oncology,2Department of Oral Pathology,Shanghai Ninth People's Hospital,School of Stomatology,Shanghai Jiao Tong University School of Medicine,Shanghai 200011,China
This work was supported by the Shanghai Municipal Foundation of Talents Development(No.201447)

Objective:To investigate the potential prognostic value of cyclin D1 expression in patients with locally advanced oral squamous cell carcinoma(OSCC)and its relationship with taxol(Docetaxel)/cisplatin plus 5-fluorouracil(TPF)induction chemotherapy.Methods:A total of 256 patients with locally advanced OSCC were selected from Shanghai Ninth People's Hospital of Shanghai Jiao Tong University School of Medicine between March 2008 and December 2010 as the objects of study in this prospective randomized clinical trial.The effect of TPF induction chemotherapy was investigated.Immunohistochemical staining against cyclin D1 was performed in the pretreatment biopsy specimen of the patients.The relationship between cyclin D1 expression and prognostic data of the TPF induction arm and control arm was analyzed.Results:Cyclin D1 expression was detected in 232 out of the 256 patients.Patients with low cyclin D1 expression showed significantly better overall survival(OS)(P=0.001),disease-free survival(DFS)(P=0.003),locoregional recurrence-free survival(LRFS)(P=0.004),and distant metastasis-free survival(DMFS)(P=0.001)than those with high cyclin D1 expression.No significant differences existed in OS,DFS,LRFS,or DMFS between the patients with TPF induction chemotherapy and the control.Cyclin D1 expression levels were not predictive of the benefit from TPF induction chemotherapy in the overall population.However,patients with nodal stage cN2and high cyclin D1 expression,who were undergoing TPF chemotherapeutic regimen, showed significantly higher OS(P=0.024)and DMFS(P=0.024)than cN2patients with high cyclin D1 expression but undergoing standard surgical treatment.Conclusion:Cyclin D1 can be used as a prognostic biomarker for patients with locally advanced OSCC.Furthermore,cN2OSCC patients with high cyclin D1 expression can receive long-term benefit from the addition of TPF induction chemo-therapy to standard surgical treatment.

oral squamous cell carcinoma,cyclin D1,induction chemotherapy,biomarker

10.3969/j.issn.1000-8179.2015.16.867

①上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔颌面-头颈肿瘤科，上海市口腔医学重点实验室（上海市200011）；②口腔病理科

*本文课题受上海市人才发展资金（编号：201447）资助

钟来平 zhonglaiping@163.com