油桐delta 8脱饱和酶基因的全长cDNA克隆及序列分析

龙洪旭，谭晓风，张 琳，曾艳玲，李 泽，王 哲

(中南林业科技大学 经济林育种与栽培国家林业局重点实验室，湖南 长沙 410004)

油桐delta 8脱饱和酶基因的全长cDNA克隆及序列分析

龙洪旭，谭晓风，张 琳，曾艳玲，李 泽，王 哲

(中南林业科技大学 经济林育种与栽培国家林业局重点实验室，湖南 长沙 410004)

桐油是制备生物柴油的优势原料。delta 8脱饱和酶基因与植物膜脂、鞘磷脂的生物合成及细胞信号传递途径有关。通过简并PCR扩增、3’ RACE、5’ RACE及编码区扩增获得了油桐delta 8脱饱和酶的全长cDNA序列。该基因全长1 787 bp，ORF的长度为1 344 bp，编码447个氨基酸。经过网上比对分析，发现油桐delta 8脱饱和酶与其它植物的此基因具有较高同源性，其中与蓖麻脂肪酸去饱和酶相似度达83％。研究结果为揭示油桐油脂合成途径及分子定向育种奠定基础。

油桐；delta 8去饱和酶；简并PCR；RACE；基因克隆

油桐Vernicia fordii原产我国，是重要的工业油料树种[1]，桐油的脂肪酸组成主要有6种：软脂酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、桐酸。软脂酸与硬脂酸是饱和脂肪酸，仅占约5％，主要成分是以桐酸为主的不饱和脂肪酸，因其带有共轭双键，化学性质极为活泼，易氧化干燥，聚合成薄膜，具有不透水、不透气、不传电、抗酸碱、防腐蚀、耐冷热等特性，在化工、农业、医药、印刷、电信、航运、航天、国防及精密机械工业上有广泛用途，是重要的工业油料[2-3]，还可做燃料，是制备生物柴油的优势原料[4]。植物的delta 8脱饱和酶又称植物鞘磷脂脱饱和酶[5]，植物鞘磷脂是细胞膜的组成成分之一，最近研究显示植物鞘磷脂具有重要的信号传递作用[6]。该酶与高度不饱和脂肪酸(highly unsaturated fatty acids，HUFAs)的合成有关，能够使不饱和脂肪酸酯化成磷脂，维持细胞膜的流动性，它与植物膜脂、鞘磷脂的生物合成相关[7-10]。HUFA与植物的抗冻性有关，四川大学陈放、卿人韦等[5]克隆到一个麻疯树delta 8脱饱和酶基因，瞬时表达结果显示，此基因在胚乳发育早期有较高表达，在细嫩叶片和细嫩果实的青果皮中表达量较低，在其它时期的组织器官中不表达。可能是一个结合在内质网膜上的delta 8脱饱和酶基因，与细胞的信号传递途径有关，具有潜在研究价值。

1 材料与方法

1.1 材 料

2009年8月底，以湖南省长沙市天际岭林场对年桐果实为材料，-80℃超低温冰箱保存。大肠杆菌DH5α，质粒载体pMD18-T、rTaq DNA聚合 酶、10×PCR Buffer(with Mg2+)、Pyrobest DNA Polymerase购自Takara，3’ RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends，5’RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends，PureLinkTMMicro-to-Midi Total RNA Purification System 购自Invitrogen，First Strand cDNA Synthesis kit购自 Fermentas，pEASY-Blunt Simple Cloning Kit购自全式金公司，其它常规试剂均使用国产分析纯。

1.2 方 法

1.2.1 油桐种子总RNA提取

以Invitrogen Total RNA Puri fi cation Kit为基础，采用cTAB裂解进行改进，先取配制好的1.2mL CTAB裂 解 液(3％ CTAB，1.5 M NaCl，10 mM EDTA，30 mM Tris，pH 7.0,2％ pvp-40)加入到1.5mL无RNase的离心管中，加20 µL β-巯基乙醇。65℃预热10min。在液氮中将油桐种子研磨充分，装入预冷的1.5mL的离心管中(每管不多于250mg)。向离心管迅速加入600 µL预热好的CTAB裂解液，涡旋混匀，65℃加热10min，每3min涡旋1次。加入600 µL的氯仿，涡旋振荡4min，使其充分裂解。后续步骤参照Invitrogen RNA试剂盒说明书。

1.2.2 单链cDNA的合成

油桐种子单链cDNA合成参照Fermentas试剂盒说明书进行。

1.2.3 简并片段的扩增

根据GeneBank中登录的delta 8脱饱和酶基因氨基酸序列(Jatropha curcas ABP01349.1、Ricinus communis XP_002511936.1、Brassica napus CAA11857.1、Helianthus annuus CAA60621.1、Arabidopsis thaliana NP_191717.1)设计简并引物扩增JBD8F(GATTGGRYNAAAGANCATCC)，JBD8R(TTATGVKTCCATTTCCACCA)，扩 增delta 8基因的保守区片段。50 µL PCR反应体系包含 5μL的10×PCR Buffer(with Mg2+)，4μL的 dNTP Mix(各 2.5 mM)，各 1μL 的 JBD8F、JBD8R 引物(20 μM)，0.25μL rTaq(5 U/μL)，2μL单链cDNA模板，36.75μL超纯水。PCR反应条件为94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃继续延伸7min；16℃终止反应。

1.2.4 3′RACE扩增

根据已扩增的delta 8保守序列，设计了 3′ RACE引物3R-P1(TGAATCTGGCTGG CCAAGATGTAAC)，3R-P2(CAAAGTCTCAG ATGTGTCCAGGGA)，3R-P3(TCATTGGCATC TGTTGTGTTCTTGT)；根据Invitrogen的3′RACE System for Rapid Ampli fi cation of cDNA Ends手册合成 3′RACE Ready cDNA 并进行 3′RACE 巢式扩增。

1.2.5 5′RACE扩增

将根据已扩增的delta 8保守序列及3′RACE片段的测序结果设计5′ RACE引物5R-P1(CATTCCCATTTGGAGGTC)，5R-P2(AG CAGCAAAGGAAGTAAGCACG)，5R-P3(ATGGTTCCATTTCCACCAAG)，5R-P4(TCCCTGGACACATCTGAGACTT)，根据Invitrogen的5′RACE手册进行5′RACE ready cDNA的合成及巢式扩增。

1.2.6 完整cDNA的克隆测序

将delta8的保守区片段及3′RACE和5′RACE片段进行人工拼接，得到delta 8基因的理论全长cDNA序列，以此设计完整ORF扩增引 物 QC-F(ATGGAGGGAGAAAGGAAGT)，QC-R(GGCTTCAAAGGCAACATAGA)。以 反转录的cDNA第一链为模板，进行PCR扩增，50 µL PCR 反应体系包含 5μL 10×Pyrobest Buffer II(with Mg2+)，4μL dNTP Mix(各 2.5 mM)，各1μL的 QC-F、QC-R(20 μM)引物，0.25μL Pyrobest DNA Polymerase(5U/ul)，2μL 单 链 cDNA 模板，36.75μL无菌水。PCR程序为：95℃预变性5min；95℃变性 40s，58℃退火 40s，72℃延伸3min，35个循环；72℃延伸10min；4℃终止反应。将扩增产物进行回收、连接、转化，并进行双向测序。

2 结果与分析

2.1 delta 8基因保守区序列扩增

使用cTAB裂解法配合Invitrogen植物RNA提取试剂盒，提取的油桐总RNA，如图1所示，28S与18S条带明亮，效果理想，满足实验要求。

图1 油桐种子总RNA琼脂糖凝胶电泳Fig.1 Electrophoresis of Venicia fordii seed total RNA

以此单链cDNA为模板，用简并引物JBD8F、JBD8R进行PCR扩增。取3 µL PCR产物，于1.5％的琼脂糖凝胶上电泳，得到与预期大小相符的清晰条带(图2)。经过测序确认，此片段长490 bp。可根据此部分保守序列设计RACE扩增所需引物。

图2 delta 8简并PCR电泳Fig.2 Electrophoresis of delta 8 degenerate PCR product ampli fi cation

2.2 3′RACE扩增和5′RACE扩增

以引物3R-P1、3R-P2、3R-P3与 Invitrogen 3′RACE 试剂盒进行巢式PCR扩增，1.5％琼脂糖凝胶电泳，最后由3R-P3扩增得到3′RACE清晰特异条带，经回收测序，确定序列长度1200bp(图3)，与预期相符。用引物5R-P2、5R-P3、5R-P4与Invitrogen 5′RACE试剂盒进行巢式PCR扩增，将产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，如图4所示，由5R-P4得到特异的550bp左右的条带，经回收测序确定为预期片段。

2.3 CDS扩增电泳检测

以提取油桐种子总RNA反转录的cDNA为模板，用编码区引物QC-F、QC-R进行Delta 8基因的完整ORF PCR扩增，1.2％的琼脂糖凝胶电泳结果如图5所示，获得一条特异的条带，经测序确认，此条带大小为1 400 bp，与预期结果吻合。根据测序结果进行后续分析。

图3 3′RACE产物的电泳检测Fig.3 Electrophoresis of 3′ RACE products ampli fi cation

图4 5′RACE产物电泳检测Fig.4 Electrophoresis of 5′ RACE products ampli fi cation

图5 delta-8的RT-PCR产物电泳检测Fig.5 Electrophoresis of RT-PCR products ampli fi cation of delta-8 gene

2.4 Delta 8基因的序列分析

对delta 8基因全长cDNA测序结果进行拼接后分析，如图6所示，delta 8基因全长1 787 bp，ORF的长度为1 344 bp，编码447个氨基酸，5′非编码区长243 bp，3′非编码区的长度为200 bp，3′末端有14个多聚A的poly A尾。

图6 油桐delta-8 全长cDNA序列及推导氨基酸序列Fig.6 Nucleotide sequences and deduced amino acid sequences of Delta-8 cDNA from V.fordii

表1 delta-8 全长cDNA序列的Blastn结果Table 1 Blastn results of full-length cDNA of delta-8

油桐delta 8基因全长cDNA序列在NCBI的Blastn结果如表1所示，从表中的数据可得知油桐与蓖麻的fatty acid desaturase(putative)相似性最高，达到了83％，与毛果杨fatty acid desaturase/cytochrome b5 fusion protein、毛白杨delta8-sphingolipid desaturase(D8A、D8B)的相似性均达82％。

将推导的氨基酸序列提交到网上进行蛋白质结构及功能预测，整个蛋白质是表现出疏水性的，有七个可能性较大的跨膜区域，可能不存在信号肽的切割位点，是一个非分泌性蛋白；二级结构以α螺旋结构和无规则卷曲为主，通过在线分析delta 8蛋白结构域，发现在7～80 aa位置存在一个Cyt-b5(细胞色素b5)结构域，在第136～408 aa位置存在一个FA_desaturase结构域。

将推导出的油桐delta 8去饱和酶氨基酸序列与其它植物相关的氨基酸序列用MEGA4.1软件进行UPGMA进化树分析，如图7所示，油桐delta 8去饱和酶与蓖麻脂肪酸去饱和酶同源基因(Rc FAD-like)亲缘关系最近，并与毛白杨D8去饱和酶(Pt D8SD)、大豆D8去饱和酶同源基因(Gm D8SD-like)、可可delta 8去饱和酶同源基因(Tc D8-like)聚为一类，与其它相关酶如黄瓜D8去饱和酶1(Cs D8SD1)、香瓜D8去饱和酶(Cm D8SD)、鹰嘴豆D8去饱和酶同源基因(Ca D8-like)、苜蓿D8去饱和酶(Mt D8SD)、葡萄FAD3去饱和酶(Vv FAD3)等都具有一定的亲缘关系；而同为大戟科的麻疯树D8去饱和酶(Jc D8SD)却与油茶D6去饱和酶(Co D6)聚为一类，它们与油桐delta 8去饱和酶亲缘关系相对较远。

图7 油桐delta 8与其它植物相关酶基因的的进化树Fig.7 UPGMA evolution tree based on delta 8 of V.fordii and related desaturase genes from other plants

4 讨 论

油桐delta 8脱饱和酶的序列分析显示，在氨基酸序列的N端存在一个细胞色素B5结构域，在靠近C端存在一个FA_desaturase结构域，进化分析表明，delta 8脱饱和酶与某些其它脂肪酸去饱和酶如FAD3、delta 6脂肪酸去饱和酶有一定的亲缘关系，这可能与脂肪酸去饱和酶共同的FA_desaturase结构域有关。Federico等[11]在研究烟草中delta6去饱和酶活性时，克隆到了一个delta 8去饱和酶，进化分析表明烟草delta 8去饱和酶与玻璃苣、青檀delta 6去饱和酶聚为一类。它在烟草的花、叶、果实及发育中的种子中大量表达，且表达量与发育阶段紧密相关，在生长旺盛的组织中表达量最高，这种表达模式与已鉴定的紫草科植物delta 6酰基去饱和酶类似。而在酵母中表达烟草delta 8去饱和酶基因的结果显示，此酶无delta 6去饱和酶活性，却能在鞘脂delta 8位置引入双键，使之脱饱和。delta 8鞘脂去饱和酶在植物中分布更广泛，而delta 6酰基去饱和酶的分布更受限制[12]，有可能delta 8去饱和酶比delta 6去饱和酶在进化上更加原始，而且不同delta 8去饱和酶可能具有不同的鞘脂底物偏好性[13-17]。

本实验通过设计油桐delta 8基因简并引物，进行PCR扩增得到delta 8基因中间部分cDNA序列，然后在此基础上设计5′ RACE和3′RACE引物，进行PCR扩增分别得到5′端和3′端部分cDNA，将简并片段、5′ RACE和3′RACE部分cDNA序列进行拼接后，得到理论全长cDNA序列，通过设计完整编码区引物，进行PCR扩增得到完整编码区序列，为油桐delta 8基因的结构和功能研究，及转基因应用奠定基础，delta 8脱饱和酶已从麻疯树、烟草等多种植物中克隆出来，但油桐中delta 8基因的研究为首次报道。今后可在此研究基础上，构建原核及真核表达载体，进行目的蛋白的检测，并鉴定酶活性，以及转基因研究等。

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Molecular cloning of full-length cDNA of delta 8 fatty acid desaturase gene from Vernicia fordii

LONG Hong-xu,TAN Xiao-feng,ZHANG Lin,ZENG Yan-ling,LI Ze,WAN Zhe
(Key Lab.of Non-wood Forest Products of State Forestry Administration,Central South University of Forestry and Technology,Changsha 410004,Hunan,China)

Tung oil of Vernicia fordii is the high-quality raw material for bio-diesel.Delta 8 fatty acid desaturase gene is related with the biosynthesis of plant membrane lipids,sphingomyelin biosynthesis and the cell signaling pathway.Full-length cDNA sequence of delta 8 desaturase gene was obtained for the fi rst time by using methods of degenerate PCR,3’ RACE and 5’ RACE from maturing seed of V.fordii.Gene’s full-length is 1 787 bp and contained a 1 344 bp ORF(open reading frame),encoding a peptide of 447amino acids.The results of comparative analysis show that delta 8 fatty acid desaturase gene from V.fordii had a high similarity to those of other plants,of them,the similarity of V.fordii to Ricinus communis delta 8 gene reached 83％.The fi ndings laya foundation for revealing the lipid synthesis pathway and molecular directed breeding.

Vernicia fordii; delta 8 desaturase; degenerate PCR; RACE; gene cloning

S794.3

A

1673-923X(2015)07-0012-05

10.14067/j.cnki.1673-923x.2015.07.003

2014-10-10

国家林业公益性行业科研专项重大项目(201204403)；湖南省研究生科研创新基金资助项目(CX2014B327)

龙洪旭，博士研究生

谭晓风，教授，博士，博士研究生导师；E-mail：tanxiaofengcn@126.com.cn

龙洪旭，谭晓风，张 琳，等.油桐delta 8脱饱和酶基因的全长cDNA克隆及序列分析[J].中南林业科技大学学报,2015,35(7)：12-16,26.

[本文编校：吴 毅]