比色法测定木通属植物总皂苷含量的研究

高 伟 ，李 遵 ，段伟华 ，幸伟年 ，占志勇 ，孙 颖 ，龚 春 ，彭以元

（1.江西师范大学，江西 南昌 330022；2. 江西省林业科学院，江西 南昌 330013；3.江西省林业科技实验中心，江西 信丰 341616）

比色法测定木通属植物总皂苷含量的研究

高 伟1，2，李 遵3，段伟华2，幸伟年2，占志勇2，孙 颖2，龚 春2，彭以元1

（1.江西师范大学，江西 南昌 330022；2. 江西省林业科学院，江西 南昌 330013；3.江西省林业科技实验中心，江西 信丰 341616）

以江西、湖南、湖北、四川，安徽五省的40份木通植物为试材，采用比色法建立木通属植物总皂苷含量的测定方法，并测定其木通藤茎中总皂苷的含量。结果表明：（1）采用甲醇超声波提取，再用大孔吸附树脂吸附，最后用水饱和的正丁醇萃取来制备样品，可以完整提取木通总皂苷；以齐墩果酸为标准物进行木通皂苷的定量测定方法适合于大量木通试样的分析。（2）分析结果表明白木通总皂苷含量最大，江西地区适合进行选育高含量木通皂苷的木通品种。

木通皂苷；白木通；江西

木通藤是双子叶植物的木通科植物白木通或三叶木通、木通（五叶木通）的木质茎。作为药用品种的主要是木通、三叶木通及其变种白木通[1]。中医药理论认为，木通味苦，性寒，具有清热利尿，活血通脉，抗菌消炎之功效，主治小便短赤，淋浊，水肿，风湿痹痛，乳汁不通，痛经等症[2]。有文献报道鸭芹的钙含量为212.25 mg/100g[3]，而三叶木通钙含量比之更高，是补钙良药。近来研究发现，木通的这些药用价值可能与其所含的皂苷密切相关。目前对木通皂苷的研究主要集中在皂苷的药理作用及其结构的鉴定[4-9]，也有研究植物内基因表达对皂苷含量的影响[10-11]，而对木通中总皂苷进行定量测定鲜见报道。在测量植物总皂苷含量时，采用香草醛－硫酸为显色剂，一般会存在稳定性差、显色不完全的问题，而香草醛——高氯酸显色体系能够显色完全，不受糖类干扰。所以本文以香草醛——冰醋酸——高氯酸为显色体系，测定木通总皂苷含量[12]。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

紫外分光光度计（岛津 UV2550 ）；电热恒温水浴锅（国华电器有限公司 HH-6）；电子分析天平（赛多利斯 ME5）；电热恒温水槽；粉碎机；旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂 RE-52A）；大孔树脂柱(内径0.8 cm，长20 cm)。

齐墩果酸标准品（中国食品药品检定研究院 批号110709-201206 含量＞98%）；大孔树脂DM-301；无水甲醇、无水乙醇、正丁醇、冰醋酸、高氯酸和香草醛等均为分析纯。木通属植物材料40份，分别采自江西、安徽、湖南、湖北和四川。

1.2 实验方法

1.2.1 对照品溶液制备

称取齐墩果酸标准品（中国食品药品检定研究院 批号110709-201206 含量＞98%）13.95 mg于10 mL容量瓶中，甲醇溶解定容，制成溶液A（浓度为1.395 mg/mL）；取溶液A 5 mL于25 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度线，制成溶液B（浓度为0.279 mg/mL）。

1.2.2 样品溶液制备

1）新鲜木通藤茎清洗晾干表面水后贮于通风干燥处，至含水量6 %时，制成粉末。用4号筛（筛孔内径：250 μm±9.9 μm ，65 目）取粉末 0.4 g，置于100 mL锥形瓶中，称重。

2）用50 mL甲醇萃取，超声波辅助提取1 h，过滤，精确取滤液25 mL于蒸发皿中，水浴蒸干。

3）水溶解残留物所得溶液经大孔吸附树脂柱(径高比1：5)洗脱：先以水冲洗大孔树脂，弃去冲洗水；再以95 %乙醇洗脱，水浴蒸干乙醇洗脱液。

4）25 mL 水分5次将残留物溶解并转移至分液漏斗中，以20 mL水饱和的正丁醇萃取4次，收集合并正丁醇层，减压蒸干。用70 %甲醇将残留物溶解转移至10 mL量瓶中，定容，摇匀，即得样品液。

1.2.3 测定方法与测定波长

本实验采用比色法，显色条件为5%香草醛-冰醋酸（香草醛5克，加冰醋酸溶解成100 mL，即得，临用新配，下同，称溶液C）0.3 mL、高氯酸（溶液D）用量0.7 mL、显色时间25 min、显色温度50 ℃，以5 mL冰醋酸终止反应。

本实验采用的测定波长为560 nm。

2 结果与分析

2.1 标样选择

研究指出，木通属植物皂苷的主要化学成分为齐墩果烷型的五环三萜皂苷。木通皂苷的结构单元苷元主要是从齐墩果酸的结构基础上氧化为去甲常春藤皂苷元、常春藤皂苷元、去甲阿江榄仁酸、阿江榄仁酸等4种皂苷元[13]。中国药典已经有用液相法测定木通中的齐墩果酸含量的标准，证明木通藤含有一定量的齐墩果酸，而齐墩果酸也是皂苷类成分，用它作对照品就更具代表性。因此本实验选择齐墩果酸为标准物进行含量测定。

2.2 显色条件与测定波长

甾体皂苷分子与浓硫酸、高氯酸等强氧化酸反应后，因分子内发生脱羧、氧化、脱水、及形成碳正离子等原因，使皂苷分子在200～600 nm范围内出现一定强度的吸收,常运用这一反应来定量皂苷的含量[14-15]。本实验利用甾体皂苷结构单元之一的齐墩果酸与显色剂发生显色反应，通过分光光度计测定木通属植物的总皂苷含量。其中，反应时间、反应温度及显色剂用量是影响显色的关键。在预实验过程，采用单因素实验设计对反应时间、反应温度、显色剂用量进行优化，最终确定5%香草醛-冰醋酸0.3 mL、高氯酸用量0.7 mL、显色时间25 min、显色温度50 ℃为本实验的最佳显色条件。

本实验中以齐墩果酸对照品溶液A的稀释液为样品在400～700 nm 波长范围内进行扫描，发现560 nm处有最大吸光度。同样，发现供试品溶液也在560 nm波长处吸光度最大（图1），故确定测定波长为560 nm。

图1 齐墩果酸对照品溶液扫描图Fig.1 The sscannogram of Oleanolic acid reference substance solution

2.3 皂苷提取方法确定

索氏抽提法为皂苷含量的常用方法，但对皂苷不能抽提完全且操作繁琐、过程费时，难以满足大批量样品的统一测定。

本实验中以甲醇超声波后的样品残渣为对象，进行皂苷含量检测，结果表明甲醇超声波1 h后的样品残渣中未检出皂苷含量（表1）。表明以甲醇超声波提取1小时后，再通过大孔吸附树脂吸附，进而用水饱和正丁醇萃取的方法能完全将木通中的皂苷提取出来。

表1 甲醇超声波处理样品后吸光度检测数据Table 1 Absorbance detection data after ultrasonic processing sample with methanol

2.4 线性关系考查

于5支10 mL具塞试管中精确取置齐墩果酸对照品溶液A各0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，水浴蒸干，加溶液C 0.3 mL，溶液D 0.7 mL，于50℃水浴显色25 min后，冰浴冷却15 min。冰醋酸5 mL以终止反应。以溶液C 0.3 mL，溶液D 0.7 mL及5 mL冰醋酸混合溶液为空白，每个样品测定吸光度3次，取其平均值。

表2 回归曲线数据Table 2 The regression curve data

以试管中皂苷的质量浓度为自变量，测定的吸光度为因变量，标制作标准曲线。回归方程分别为：y= 1.430 1x+0.012 8，R2=0.998 5，表明该方程适合木通总皂苷含量的测定。

2.5 精密度、稳定性及加样回收实验

1）精密度实验

新鲜木通藤茎清洗晾干表面水后贮于通风干燥处，按照1.2.2方法平行制定5份样品溶液，每份样品吸取2.0 mL，按照1.2.3所述测定方法，进行显色反应测定吸光度。通过精密度实验，对平行制定的5份样品溶液进行测量（数据见表3），各结果之间的相对标准偏差小于1%，表明仪器精密度良好。

表3 精密度实验数据Table 3 The precision of the experimental data

2）稳定性实验

取齐墩果酸对照品溶液B6份，每份2.0 mL，分别静置1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h后，按照1.2.3所述测定方法，进行吸光度测定。6份对照品在静置不同时间段后，各份样品之间的吸光度（数据见表4）相对标准偏差均小于0.5%，表明对照品溶液在10 h之内稳定。

表4 稳定性实验数据Table 4 Stability of the experimental data

3）加样回收实验

精确称取已知含量木通粉末0.4 g，9份，随机分3组，按照供试品溶液制备方法制备样品液。各于3组样品液5 mL中分别加入0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL对照溶液B，进行吸光度测定，并计算回收率。

加样回收实验的结果如表5所示。计算出齐墩果酸对照品的平均回收率分别为99.56 %，RSD为1.77 %。说明本法回收率好，方法可行。

表5 齐墩果酸对照品溶液加样回收实验结果Table 5 Oleanolic acid reference substance solution with sample recovery experiment results

2.6 木通样品含量测定

本实验提供40批木通藤粉末，分别称重0.4 g（M）。按供试品溶液制备方法制备样品溶液，精密取样品溶液2 mL，置具塞试管中，水浴蒸干，加入溶液C 0.3 mL，溶液D 0.7 mL，50℃水浴显色25 min后，冰浴冷却15 min，加冰醋酸5 mL，以猝灭反应，摇匀，测定吸收度A值，计算含量，结果见表6。

表6 各地区不同品种木通总皂苷含量Table 6 The total saponin content of different varieties among regions

3 结论与讨论

总皂苷测定方法有很多种，各种测定方法各有特点，沉淀法会导致皂苷变质，还会有杂质存在；层析法误差大，成本高；溶血指数法只适用于具有溶血作用的皂苷，虽然此方法简单，快速；本实验采用比色法测定木通属植物总皂苷含量，该方法简便，快捷，准确，便于对木通药材进行质量控制。

皂苷因亲水性较强，用氯仿、乙醚等提取率低，需要用微波辅助提取[16]，水饱和后正丁醇液极性增大，有利于提出皂苷类成分。由于水与正丁醇互溶度较大，将正丁醇加入水中进行提取操作时，两相体积将发生变化，而正丁醇用水饱和后，两相体积恒定，萃取操作两相体积将不会变化，可准确控制。而索氏抽提法为皂苷含量的常用方法，但对皂苷不能抽提完全且操作繁琐、过程费时，难以满足大批量样品的统一测定。

木通皂苷的结构单元苷元主要是从齐墩果酸的结构基础上氧化为去甲常春藤皂苷元、常春藤皂苷元、去甲阿江榄仁酸、阿江榄仁酸等4种皂苷元[13]。通过实验确定在560 nm处齐墩果酸对照品及供试品均具有最大吸光度，并且用齐墩果酸作为标准物质进行总皂苷的测定，其回归方程为：y= 1.430 1x+0.012 8，R2=0.998 5。

从表6可知：各地区白木通平均皂苷含量为1.23%，变异系数为0.70；三叶木通平均皂苷含量为0.98%，变异系数为0.22；五叶木通平均皂苷含量为1.11%，变异系数为0.20。由此可知白木通总皂苷含量最大，从各个地区的角度分析：江西地区木通总皂苷含量平均为1.27%，安徽为0.86%，湖南为0.75%，湖北为1.07%，以及四川的1.19%。江西地区及四川地区木通总皂苷相对较高。从结果可知，江西地区适合选育高含量木通皂苷的木通品种。

由此可知对40批次木通总皂苷含量测定测定结果表明，各批次之间含量接近，变异系数均不大，说明本实验建立的分离提纯方法是稳定的。

试验结果表明：该方法精密度、稳定性较好，平均回收率为99.56%，回收率极差范围为4.88%，可以用于木通药材及木通制剂的质量控制，适用于大批量木通药材样品中总皂苷含量的统一测定。

[1]刘岩庭,侯雄军,谢 月,等. 木通属植物化学成分及药理作用研究进展[J]. 江西中医学院学报, 2012, 24(4)： 87-92.

[2]中国科学院中国植物志编委会. 中国植物志第二十九卷[M].北京： 科学出版社, 2001.

[3]陆 俊, 刘 婷, 李忠海. 用火焰原子吸收光谱法测定3种野生蔬菜中7种矿物质含量[J]. 中南林业科技大学学报, 2013,33(1)： 119-122.

[4]Mimaki Y, Kuroda M, Yokosuka A. Triterpenes and trit erpene saponins from the stems of Akebia trif oli ata[J]. Chem Pharm Bull , 2003, 51(8)： 960-963.

[5]Jung H, Lee C, Lee K,et al.Struct ure-activity relat ionship of oleanane disaccharides isolat ed from Akebia quinata versus cytotoxicity against cancer cells and NO inhibition[J]. Biol Pharm Bull , 2004,27(5)： 744-748.

[6]马双成, 陈德昌, 赵淑杰. 中药八月扎( 白木通) 果皮的化学成分研 [J]. 中草药 , 1993, 24(11)： 563-566.

[7]马双成, 陈德昌, 赵淑杰. 白木通种子中3位单糖链皂甙化合物 [J]. 中草药 , 1994, 25(4)： 171-175.

[8]王 晔, 鲁 静, 林瑞超. 三叶木通藤茎的化学成分研究[J].中草药 , 2004, 35(5)： 495-498.

[9]何仰清, 高黎明, 魏小梅.八月扎化学成分的研究[J].西北师范大学学报：自然科学版, 2004, 40(3)： 38-41.

[10]邢朝斌, 龙月红, 劳凤云, 等. 刺五加鲨烯合酶基因的表达及其对皂苷含量的影响[J]. 经济林研究, 2013, 31(1)： 25-29.

[11]邢朝斌,孟春燕,修乐山,等. 不同性别刺五加皂苷合成酶基因表达及其对皂苷含量的影响[J].经济林研究, 2013, 31(3)：81-85.

[12]陆蕴如, 邵爱新. 用香草醛—硫酸比色法测定次片甘草及蜜灸甘草中甘草酸的含量[J]. 药物分析杂志, 1981, 1(2)：84.

[13]高慧敏, 王智民. 木通属药用植物研究进展[J]. 中国中药杂志 , 2006, 31(1)： 10-14.

[14]Itokawa H, Ikuta A. 30-Newoleanane saponins from callus tissues of Akebia quinata[J]. Phyt ochemistry, 1989, 28(10)： 2663-2665.

[15]Ikuta A. Saponins and triterpenes from callus tissue of Akebia trif oliata and comparison with the constituents of other Lardizabalaceous callus tissue[J]. J Nat Prod, 1995, 58(9)： 1378-1383.

[16]胡尚力, 王义强. 三七花总皂苷的微波辅助提取[J]. 中南林业科技大学学报，2010,30(9)：137-140.

Akebia plants total saponin content colorimetric determination method of research

GAOWei1,2, LI Zun3, DUAN Wei-hua2, XING Wei-nian2, ZHAN Zhi-yong2, SUN Ying2, GONG Chun2, PENG Yi-yuan1
(1. Jiangxi Normal University, Nanchang 330022, Jiangxi, China; 2. Jiangxi Academy of Forestry, Nanchang 330013, Jiangxi, China;3. Jiangxi Forestry Science and Technology Experiment Center, Xinfeng 341616, Jiangxi, China)

Use colorimetric method to determine the content of total saponins in Akebia plants, and the determination of the jiangxi,hunan, hubei, sichuan, anhui 40 copies of akebia stem in the five provinces of total saponins content in the stem had been researched.The results are showed that： (1) Using methanol ultrasonic extraction, again with macroporous adsorption resin adsorption, the water saturation of n-butyl alcohol extraction to the preparation of samples, could complete extraction total saponins. With oleanolic acid as the standard content of akebia stem saponins quantitative determination method was suitable for a large number of akebia stem analysis of samples. (2) The analysis results showed that the maximum total saponin content was akebia trifoliata varaustralis, jiangxi area was suitable for breeding high content of akebia stem saponins of akebia stem varieties.

Akebia saponin, akebia trifoliata varaustralis, Jiangxi province

S781.41

A

1673-923X(2015)10-0134-04

10.14067/j.cnki.1673-923x.2015.10.023

2014-12-04

国家林业局2013年林业公益性行业科研专项“木通科特色蓇葖果良种选育及高效栽培技术研究”（201304802）

高 伟，硕士，助理研究员；E-mail：284256805@qq.com

高 伟，李 遵，段伟华，等. 比色法测定木通属植物总皂苷含量的研究[J].中南林业科技大学学报，2015, 35(10)： 134-137, 146.

[本文编校：吴 彬]