直立冬青半同胞家系多样性研究

杨玉洁，张冬林，董进英，李志辉，金晓玲

(1.中南林业科技大学 a.林学院；b.风景园林学院，湖南 长沙410004；2.乔治亚大学，美国 乔治亚 雅典 30602)

直立冬青半同胞家系多样性研究

杨玉洁1a,2，张冬林2，董进英2，李志辉1a，金晓玲1b

(1.中南林业科技大学 a.林学院；b.风景园林学院，湖南 长沙410004；2.乔治亚大学，美国 乔治亚 雅典 30602)

以直立冬青母树及其子代36株植株组成的半同胞家系为研究对象，采用观察统计和ISSR分子标记技术，分别对其形态特征和分子水平进行了相关性分析和遗传多样性研究。研究结果表明：（1）在直立冬青良种选育过程中，应选取具有节数少、树形高、冠幅小、叶子长且宽大的直立冬青个体进行培育。（2）ISSR分子标记能够区别半同胞家系内的个体差异，且效果显著。（3）直立冬青子代半同胞家系的遗传多样性较为丰富。

冬青；直立冬青；半同胞家系；遗传多样性；开放授粉；ISSR

直立冬青Ilex crenata‘Sky Pencil’属于冬青科冬青属常绿灌木齿叶冬青的选育品种，齿叶冬青原产于中国东部、日本、韩国、萨哈林、菲律宾以及喜马拉雅山脉。因其枝叶稠密、常绿，作为观赏植物被广泛种植于北美东南部[1]。直立冬青的外形别具一格，该品种分枝多且直立向上，无需修剪便可自然成柱形。在园林绿化的生产应用中，是省工省地、耐寒耐旱且适种范围广的节约型树种，可作为孤植、绿篱以及高速公路隔离带等。近几年，在我国苗木市场上，观赏苗木新品种的研发和推进越来越受到关注。一般来说，突变和杂交是获得新品种的两个主要途径。自然突变是一个偶然现象，具有不可控的特点。杂交则成为了选育新品种的主要来源。植物品种杂交后代多样性的宽窄决定着成功选育新品种的可能性大小。因此，无论是对于人工授粉还是开放性授粉子代种群的多样性研究都备受期待。ISSR分子标记技术不仅能够有效区别亲缘关系相近的物种，而且还成功的运用于观赏植物的指纹图谱和遗传分析中，包括遗传多样性[2-6]、遗传关系[7]、植物品种起源[8]、植物品种鉴定[9]和植物指纹图谱[10]等。此外，ISSR分子标记在评估全缘冬青的遗传多样性[11]和冬青属植物的遗传关系[12]中也得到应用。在本研究中，为了探索开放授粉子代的变异，采用ISSR分子标记技术对直立冬青的子代半同胞家系的遗传多样性以及其形态特征进行了分析研究，为冬青新品种的选育、种质鉴定和起源提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验的供试材料采集于美国乔治亚大学园艺农场（Horticulture Farm）和麦可可苗圃(McCorkle Nurseries. Inc.)，共采集37株直立冬青的幼嫩叶片作为试验材料。采集样品枝条插入装有水的烧杯中，将烧杯放置于冰盒内带回实验室，然后放在－80 ℃低温冰箱中保存。试验中采取随机取样，对每株植物样品各个位置方向同时采集。取样的同时进行树高、树宽、高宽比、叶色、叶长、叶宽、枝节长度、分枝角度和紧凑度等形态观测数据的记录，一一对应并做好标记。

在37株直立冬青供试材料中，一株为母树，其余36株为其子代。母树种植于麦可可苗圃。子代材料采自美国乔治亚大学园艺农场，采集农场内以麦可可苗圃的直立冬青为母本的36个子代样品。所采子代样品的植株均由Michael A. Dirr 教授于2006年种植，为9年生实生苗。

1.2 总DNA的提取与检测

采用DNeasy® 植物试剂盒（购自于Qiagen公司），按其操作手册的步骤，从幼嫩叶片中提取出直立冬青子代及其母本的总DNA，通过NanoDrop LiteDNA测定仪测定总DNA的浓度和纯度。所有DNA样品浓度均用双蒸水稀释至10 ng/µL，在－20 ℃冰箱中保存备用。

1.3 ISSR-PCR反应体系及扩增程序

ISSR-PCR反应体系的总体积为20 μL。包括Master Mix 10 µL（购自美国生物应用系统公司，Applied Biosystems），10 µmol/L 引物 1.2 µL，10 ng/µL 的 DNA 模版 1.0 µL，双蒸水 7.8 µL。ISSRPCR扩增程序为：94 ℃预变性5 min后，PCR扩增35个循环，每个循环94 ℃变性30 s，50 ℃变性45 s，72 ℃延伸1.5 min，最后一个循环结束，然后在72 ℃延伸7 min，最后4 ℃保存。扩增反应在美国ABI公司的PCR9700扩增仪以及nexus gradient PCR扩增仪上进行。PCR扩增产物在1.2%的琼脂糖凝胶（含0.5 mg·L-1溴化乙锭）中电泳，电泳缓冲液为0.5×TBE，电压为120 V，电泳分离1 h后，在紫外凝胶成像分析系统下拍照保存。

1.4 引物的筛选与扩增

引物的筛选是以3个形态差异较大的DNA样品为模板，采用100条哥伦比亚大学的UBC800-UBC900ISSR引物序列对3个DNA样品进行扩增，对所有扩增图谱进行统计，筛选出条带清晰、重复性好、多态性谱带丰富的引物，作为对所有直立冬青DNA样品进行ISSR分子标记的分析引物。

1.5 数据处理与统计分析

对每个样品的扩增图谱进行统计，统计时记录清晰的条带，弱带忽略不计，对每一个位点的扩增条带按有或者无来进行记录，有扩增条带赋值为“1”，无扩增带赋值为“0”，形成0 1数据矩阵图。采用SPSS软件对直立冬青群体的形态特征进行相关性分析，利用POPGENE软件对直立冬青研究群体进行遗传分析，采用PAUP4.0软件对供试材料的个体进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 直立冬青形态特征相关性分析

通过对直立冬青母树及其子代共37株植物的树高、树宽、高宽比、叶色、叶长、叶宽、枝节长度、分枝角度和紧凑度等一系列形态特征进行观测记录，对统计结果进行相关性分析，结果如表1所示。在直立冬青的观赏应用中，直立冬青的树形是衡量其观赏价值的重要指标。由表1可知，直立冬青的高宽比与树高、叶长、叶宽存在极显著正相关，与树宽存在极显著负相关。枝散度与树宽呈极显著正相关，与节数呈显著正相关，与叶长、叶宽呈极显著负相关，与树高存在显著负相关性。紧密度与叶宽呈现极显著正相关关系，与树宽存在极显著负相关性。因此，在直立冬青选育过程中，应该选取节数少、树高、冠幅小、叶子长、叶宽大等形态特征的幼苗进行进一步的育种工作，可以有效的选育出树形紧凑、枝叶茂盛的优良品种。

表1 直立冬青子代群体的形态特征相关性分析†Table 1 Morphology correlation analysis of Ilex crenata‘Sky Pencil’ seedlings

2.2 直立冬青ISSR-PCR引物筛选结果及其扩增效果

经过引物的筛选，共获得16条直立冬青ISSR多态性引物来分析直立冬青的遗传多样性，多态性引物序列、编号、位点数、多态位点数以及多态位点百分比等信息如表2所示。最多的位点数（22）是由引物835（(AG)8YC）扩增得到，而最少（11条）的则是由引物881（(GGGTG)3）扩增得到。每条引物扩增出的平均位点数为15.1。所有16条多态性引物共扩增出242条片段大小在150～2 000 bp的位点。在被分析的242个位点中，167个具有多态性，多态位点百分比占69%。多态位点百分比最高的引物为856，达85.7%，而最低的引物为889，47.1%。结果显示，在本研究中所应用的16条ISSR多态性引物能够充分揭示该开放授粉的冬青群体的总DNA具有较高的遗传变异。多态性引物807的PCR扩增反应得出的图谱见图1所示。

表2 16条引物对直立冬青生成的ISSR多态性结果†Table 2 ISSR results generated by 16 primers in 36 Ilex crenata seedlings and Ilex crenata ‘Sky Pencil’

图1 引物807对24个子代扩增的ISSR-PCR效果Fig.1 ISSR PCR band pattern of 24 half siblings from Primer UBC807

2.3 遗传多样性分析

利用PAUP和POPGENE软件对16条多态性引物扩增所得的冬青DNA指纹图谱二维矩阵进行遗传多样型分析，根据有效的ISSR条带计算出了个体遗传距离。个体遗传距离的范围为0.132 23～0.351 24。最小的个体遗传距离值存在于冬青＃08与冬青＃31之间，而最大的个体遗传距离则是齿叶冬青母本与冬青＃1之间。利用ISSR引物对所有样品进行分析得出的等位基因观察值、有效等位基因、Nei’s遗传多样性以及Shannon’s遗传指数分别为1.596 4，1.417 9，0.235 9，0.344 4（见表3）。与冷欣[10]对全缘冬青相关的分析相比较，直立冬青的子代具有更高的变异性。结果说明，直立冬青半同胞家系的遗传多样性比全缘冬青更丰富，遗传基础更宽。

表3 冬青子代群体ISSR分子标记遗传多样性分析†Table 3 Genetic variations using ISSR markers in the Ilex seedling population

利用PAUP4.0软件根据个体遗传距离构建的个体样本遗传关系UPGMA聚类图如图2所示。在该聚类图中，所有的样品被划分为3个大组。齿叶冬青母树单独聚为一组。组2包括3个样品，冬青＃05，冬青＃15和冬青＃34。其余的子代被分为第3组。直立冬青形态特征见表1。直立冬青母树具有十分显著的特征，其树形笔直细窄，如铅笔般直冲天空，因其而得名。在所研究的36个子代中，并没有任何一个个体具有跟母本一样独特的树形特征。在组2中，冬青＃05，冬青＃15以及冬青＃34具有相似的形态特征。组2中的所有个体的树形均是紧凑的椭圆形，树叶大小一致并且叶缘锯齿从叶中部开始直至叶尖。无论从形态还是分子水平来看，都能得出组2与组3的花粉贡献者很有可能不同。Dirr[1]在《木本观赏植物手册》一书中列出齿叶冬青的61个栽培变种。根据这些栽培变种的形态特征，我们假设呈球状树形和具深绿色平滑光泽叶的‘Compacta’是父本之一。另一个父本为‘Beehive’，具稠密浓郁的外形，紧凑草堆形，树冠的宽比高稍大，树叶呈深绿色，有光泽。由这两个父本的形态特征，我们不难推测出‘Compacta’是组2的父本，而‘Beehive’则是组3 的父本。组3 中的植物具有极高的变异性。组3的假定父本，‘Beehive’源于Ilex crenata‘Convexa’ ×Ilex crenata‘Stokes’的杂交，并且在乔治亚州的试验中，叶呈淡橄榄绿。‘Convexa’的树形从圆形到铺展形，具有绿色无光泽叶，叶呈翻转形，像小船。‘Stokes’树形呈圆形，叶有光泽。在组3中，具有翻转叶的植株的这一特征可能遗传自‘Convexa’。虽然组3中的植物具有相同的推测父本，但是它们在形态和遗传水平上表现极高的离散性。这个结果表示，即使它们具有相同的基因来源，来自于亲本的遗传贡献也并不是各占一半。遗传力的估算可能来自于表现变异与遗传和环境因子共同作用，或者说，在后代群体中，并不是简单的计算而是值得深究的基因重组。

图2 基于ISSR分子标记的直立冬青UPGMA聚类Fig. 2 UPGMA dendrogram of Ilex crenata ‘Sky Pencil’ (HD0) and its 36 seedlings based on ISSR markers

3 结论与讨论

通过对直立冬青母本及其子代半同胞家系的形态特征与ISSR分子标记的遗传分析，主要得出以下结论：

（1）通过SPSS软件对直立冬青母本及其子代半同胞家系的形态特征进行了相关性分析，结果显示，在直立冬青良种选育过程中，应选取具有节数少、树形高、冠幅小、叶子长且宽大的直立冬青个体进行培育。

（2）通过PAUP4.0软件对直立冬青母本及其子代半同胞家系进行了个体分析，所有供试的37株个体样品均被分离出来，说明ISSR分子标记能够区别直立冬青母本及其子代半同胞家系内的个体差异，且效果显著。

（3）直立冬青子代半同胞家系具有较高的遗传多样性水平。从遗传多样性的各个参数指标来看，多态位点百分率（69%），Nei’s基因多样性（0.235 9）以及Shannon信息指数（0.344 4）等均表明该半同胞家系的遗传多样性程度较为丰富。

无论从形态特征还是ISSR分子标记结果，我们都能得出子代群体具有很高的遗传和形态多样性。开放授粉被证明能有效的拓宽植物育种的遗传基础，同时也保证了在栽培育种的后代中，具有充足的变异性，为植物优良品种的选育打好根基。植物的选育应该从F1代开始，F1代也具有植物选育的条件。无论植物的形态特征还是遗传基因，在F1代就已经出现分化，使其具有了特异性。分子标记的价值也体现在对植物育种的遗传多样性和遗传关系的评估中。进一步的研究将着重于研究探讨亲本之间的遗传贡献率。

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Diversity of half-sib families ofIlex crenata‘Sky Pencil’

YANG Yu-jie1a,2, ZHANG Dong-lin2, DONG Jin-ying2, LI Zhi-hui1a, JIN Xiao-ling1b
(1.a. College of Forestry, b. College of Landscape Architecture, Central South University of Forestry & Technology, Changsha, 410004,Hunan, China; 2. University of Georgia, Athens, 30602 Georgia, USA)

Genetic diversity and morphology correlation analysis ofIlex crenata‘Sky Pencil’ mother tree and its 36 seedlings were studied using ISSR markers and morphology traits selection in our study. The results were as follows: (1)Ilex crenata‘Sky Pencil’seedlings with less nodes, higher, narrower, and bigger leaves traits should be collected for culture in new cultivar selection. (2) ISSR markers could discriminate clearly all clones inIlex crenata‘Sky Pencil’ siblings. (3) Both morphological and ISSR marker results concluded that the seedling population had high genetic and morphological diversity.

Ilex;Ilex crenata‘Sky Pencil’; half-sib families; genetic diversity; open pollination; ISSR

S718.46 文献标志码：A 文章编号：1673-923X(2015)12-0046-05

2015-05-18

美国乔治亚大学研究基金：乔治亚木本植物新品种开发（25-21-RC297-295）

杨玉洁，博士研究生；E-mail：seesee2824@sina.com

杨玉洁，张冬林，董进英，等. 直立冬青半同胞家系多样性研究[J].中南林业科技大学学报,2015,35(12):46-50.

[本文编校：文凤鸣]