糯米糠抗氧化肽的制备工艺及自由基清除能力研究

李俐桦，殷钟意，郑旭煦，，*

（1.重庆工商大学环境与生物工程学院，重庆400067；2.重庆工商大学催化与功能有机分子重庆市重点实验室，重庆400067）

糯米糠抗氧化肽的制备工艺及自由基清除能力研究

李俐桦1，殷钟意2，郑旭煦1，2，*

（1.重庆工商大学环境与生物工程学院，重庆400067；2.重庆工商大学催化与功能有机分子重庆市重点实验室，重庆400067）

为开发利用糯米糠资源，研究了糯米糠抗氧化肽的制备工艺及自由基清除能力。选取中性蛋白酶为水解酶，以抗氧化肽还原力为指标，采用单因素实验和正交实验方法优化糯米糠抗氧化肽的制备工艺。结果表明，制备糯米糠抗氧化肽的最佳工艺条件为糯米蛋白底物浓度4%、[E]/[S]2%、pH7、酶解温度40℃、酶解时间6h，在该条件下制备的糯米糠抗氧化肽对羟基自由基和超氧阴离子自由基的清除能力明显优于米糠抗氧化肽，且存在一定的量效关系，提示糯米糠抗氧化肽可用作功能性食品或天然抗氧化剂被深入研究和开发利用。

糯米糠，抗氧化肽，酶解，自由基清除能力

米糠是大米加工的下脚料，含有米皮层或米胚碎米等，油脂含量14%～24%，蛋白质含量12%～18%；我国是世界上米糠资源最为丰富的国家，但米糠有效利用率较低，大多用作饲料，资源浪费较为严重，因此联合国工业发展组织将其称为一种未充分利用的原料[1]。近年来，随着科技的不断进步，米糠资源正逐步被国内外学者关注，深加工产品主要有稻米油、蛋白、植酸、膳食纤维、高蛋白饲料粉与抗氧化肽等，它们在食品、饲料、医药行业等均有广泛应用前景[2]。但是，国内外关于糯米糠的研究极少，除早期可见糯米糠成分[3]和近期可见糯米抗氧化肽[4]的研究报道外，有关糯米糠深加工产品的开发利用鲜见报道。

众所周知，清除自由基并防止其氧化作用对人体细胞及组织造成破坏的研究非常重要。多项研究表明[1，5-7]，水解米糠蛋白而获得的抗氧化肽不仅对自由基具有较强的清除作用，而且本身无任何毒副作用，其开发利用前景看好。近期本课题组研究发现，糯米糠的组成以及蛋白质含量和氨基酸组成不同于米糠，而糯米糠的抗氧化肽是否也有异于米糠抗氧化肽。为此，本文以糯米糠为原料，以米糠为对照，通过研究糯米糠抗氧化肽的制备工艺及自由基清除能力，旨在为糯米糠深加工产品的开发利用提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

糯米糠、米糠重庆市长寿区凤城镇；脱脂糯米糠、米糠采用超临界CO2萃取油脂后的糯米糠和米糠；中性蛋白酶9068-59-1（酶活力≥100U/mg） 上海金穗生物科技公司（BR）；氢氧化钠、盐酸、三氯乙酸、铁氰化钾、Tris等均为国产分析纯。

二元智能水浴HH-S2郑州长城科工贸有限公司；高速冷冻离心机Biofuge Stratos D-37520 Osterode；PB-10酸度计赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；V-1200可见光分光光度计MAPADA；微量移液器上海昂精密科学仪器有限公司制造；CL-4A型平板加热磁力搅拌器郑州长城科工贸有限公司；DZF-1B型真空恒温干燥箱上海跃进医疗器械厂。

1.2实验方法

1.2.1糯米糠抗氧化肽的制备工艺

1.2.1.1糯米糠蛋白的制备工艺首先将脱脂糯米糠粉碎，在烘箱中干燥15min，使其水分含量不高于8%；然后用pH10.0的NaOH溶液（1∶100）浸提3h，离心分离10min；最后用HCl溶液调节上清液的pH至4.5，待沉淀完全后，在6000r/min离心10min，将沉淀干燥，得到糯米糠蛋白[8]。

1.2.1.2糯米糠抗氧化肽的制备工艺首先在100℃水浴锅中放入已配好一定底物浓度的糯米糠蛋白，加热20min，进行蛋白质变性处理；然后冷却至室温后，加入中性蛋白酶，调节pH，在不同条件下进行酶水解；最后将水解液于90℃水浴锅中加热20min，再6000r/min离心10min，将清液真空干燥至水分含量不高于8%，得到糯米糠抗氧化肽，测定其性能指标[6]。

综上所述，制备工艺流程为：脱脂糯米糠→粉碎烘干→浸提→离心分离→酸水解→离心分离→沉淀干燥→糯米糠蛋白→糯米糠蛋白溶液→热变性处理→酶水解→灭酶→离心分离→浓缩干燥→糯米糠活性肽→性能测定。

1.2.1.3糯米糠抗氧化肽制备的单因素实验

a.不同糯米蛋白底物浓度对还原力的影响以米糠抗氧化肽的还原力为指标，在[E]/[S]为2%、pH为7、酶解温度为40℃、酶解时间为5h的条件下，分别选取糯米蛋白底物浓度为2%、3%、4%、5%、6%，按照1.2.1.2方法进行实验。

b.不同加酶量[E]/[S]对还原力的影响以米糠抗氧化肽的还原力为指标，在底物浓度为3%、pH为7、酶解温度为40℃、酶解时间为5h的条件下，分别选取加酶量[E]/[S]为1%、2%、3%、4%、5%，按照1.2.1.2方法进行实验。

c.不同pH对还原力的影响以米糠抗氧化肽的还原力为指标，在底物浓度为3%、[E]/[S]为2%、酶解温度为40℃、酶解时间为5h的条件下，分别选取溶液pH为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0按照1.2.1.2方法进行实验。

d.不同酶解温度对还原力的影响以米糠抗氧化肽的还原力为指标，在底物浓度为3%、[E]/[S]为2%、pH为7、酶解时间为5h的条件下，分别选取酶解温度为35、40、45、50、55℃按照1.2.1.2方法进行实验。

e.不同酶解时间对还原力的影响以米糠抗氧化肽的还原力为指标，在底物浓度为3%、[E]/[S]为2%、pH为7、酶解温度为40℃的条件下，分别选取时间为2、3、4、5、6h，按照1.2.1.2方法进行实验。

1.2.1.4糯米糠抗氧化肽制备的正交实验在单因素实验的基础上，采用L16（45）正交表（见表1）进行正交实验，确定米糠抗氧化肽制备的最佳酶解工艺。

表1　酶解反应因素水平表Table.1　Factors and levels of enzymatic hydrolysis

1.2.2性能指标测定

1.2.2.1还原力的测定其反应原理[9]为K3Fe（CN）6与抗氧化剂混合后被还原成K4Fe（CN）6，K4Fe（CN）6进一步与Fe3+发生反应生成绿色Fe4[Fe（CN）6]3，其在700nm波长处有较大的吸收，吸光值越大，则抗氧化剂的还原能力越强。其测定方法[1]为：在15mL试管中分别加入糯米糠抗氧化肽样品1mL、磷酸盐缓冲液（0.2mol/L pH6.6）2.5mL和1%铁氰化钾5mL。在50℃水浴中反应20min，然后加入10%的三氯乙酸5mL，摇匀，吸取上清液2.5mL，加入2.5mL蒸馏水和0.5mL的 0.1%的三氯化铁溶液，最后在700nm处测定吸光值。以样品的吸光度值代表其抗氧化肽的还原力。

1.2.2.2羟基自由基的清除率测定配制浓度为9× 10-3mol/L的水杨酸-乙醇溶液、9×10-3mol/L双氧水和9×10-3mol/L的硫酸亚铁溶液。以75%乙醇为空白对照，分别加入1mL水杨酸-乙醇溶液，依次加入不同体积的糯米糠或米糠抗氧化肽样品溶液、1mL硫酸亚铁溶液和1mL双氧水，加盖摇匀，静置1h，然后稀释至10mL以终止反应，最后在510nm下测定吸光度值。

清除率（%）=（A0-A）/A0×100（A和A0分别表示加入样品溶液和空白液后的吸光度值）。

1.2.2.3超氧阴离子的清除率测定配制0.1mol/L pH为8.0的Tris-HCl缓冲液，按表2加样后迅速混匀，在320nm下每隔30s读取吸光度，反应4.5min结束[6]。

清除率（%）=（A0-A）/A0×100

式中，A和A0分别表示加入抑制物和双蒸水后的邻苯三酚的自氧化速率，即每分钟光吸收的平均变化率。

表2　活性肽清除O2-·加样表Table.2　Sample table of antioxidant peptides for scavenging O2-·

2　结果与讨论

2.1糯米糠抗氧化肽制备的单因素实验

2.1.1不同糯米蛋白底物浓度对还原力的影响按1.2.1.2方法进行实验的结果见图1。

图1　底物浓度对糯米糠抗氧化肽还原力的影响Fig.1　Effect of different concentration of substrate on reducing power

由图1可知，随着底物浓度增加，所得抗氧化肽的还原力呈现先增加后降低以至平缓的变化趋势；当底物浓度达到3%时，还原能力达到最大。这是因为底物浓度过低，酶与底物结合几率低，制备的抗氧化肽较少，还原力偏低；当底物浓度增加，酶与底物结合几率增加，制备的抗氧化肽增多，还原力增强；

但底物浓度过大，底物分散困难，较多的底物相互包埋，反应难度增加，导致抗氧化肽减少，还原力下降。所以，酶解适宜的底物浓度为3%。

2.1.2不同加酶量[E]/[S]对还原力的影响按1.2.1.2方法进行实验的结果见图2。

图2　[E]/[S]对糯米糠抗氧化肽还原力的影响Fig.2　Effect of different dosage of[E]/[S]on reducing power

由图2可知，随着[E]/[S]的增加，所得抗氧化肽的还原力呈现先增加后降低以至趋于稳定的变化趋势；当[E]/[S]为2%时，还原力达到最大。这是因为在一定的反应时间内，随着[E]/[S]的增加，酶的活性基团增加，加速了酶促反应，制备的抗氧化肽增多，还原力增加；但是若[E]/[S]增加过多，酶促反应过快，水解度过大，具有抗氧化活性的肽段被水解，破坏了维持其抗氧化活性的结构上的完整特征[5]，导致抗氧化肽还原力降低。所以，酶解工艺适宜的[E]/[S]在2.0%左右。

2.1.3不同pH对还原力的影响按1.2.1.2方法进行实验的结果见图3。

图3　pH对糯米糠抗氧化肽还原力的影响Fig.3　Effect of different pH on reducing power

由图3可知，糯米糠抗氧化肽的还原力随着pH的增加呈现先增加后减小的变化趋势，在pH=7.0时，还原力最强。这是因为中性蛋白酶的水解反应适宜在中性条件下进行。因此，酶解工艺适宜的pH在7.0左右。

2.1.4不同酶解温度对还原力的影响按1.2.1.2方法进行实验的结果见图4。

图4　酶解温度对糯米糠抗氧化肽还原力的影响Fig.4　Effect of different reaction temperature on reducing power

由图4可知，随着酶解温度的升高，糯米糠抗氧化肽的还原力呈现先增加后降低的变化趋势，当酶解温度为40℃时，还原力达到最大值。这是因为酶解温度较低时，酶活力增强，体系粘度降低，扩散系数增大，有利于酶促反应进行，所得抗氧化肽的还原力增加；但是，当酶解温度过高时，将引起酶受热变性，反应能力下降，导致制备的抗氧化肽还原力降低。所以，适宜的酶解温度在40℃左右。

2.1.5不同酶解时间对还原力的影响按1.2.1.2方法进行实验的结果见图5。

由图5中可知，随着酶解时间的增加，糯米糠抗氧化肽的还原力随之增强，当酶解时间超过5h后，其还原力有所下降。这可能是因为酶解时间影响了水解度，酶解时间过长，水解度过大，具有抗氧化活性的肽段被水解，导致抗氧化肽还原力下降。所以，适宜的酶解时间在5h左右。

图5　酶解时间对糯米糠抗氧化肽还原力的影响Fig.5　Effect of different reaction time on reducing power

2.2糯米糠抗氧化肽制备的正交实验

根据表1进行正交实验，实验结果见表3。

表3　正交实验结果分析表Table.3　Analysis of the orthogonal experimental results

根据表3的极差分析可知，因素主次顺序为：A＞B＞E＞D＞C，即影响糯米糠抗氧化肽还原力的因素主次顺序为：酶解温度＞底物浓度＞pH＞酶解时间＞加酶量，最佳酶解条件是A2B3C2D4E3，即酶解温度为40℃、底物浓度为4%、[E]/[S]为2%、酶解时间为6h、pH为7.0；在此条件下，还原力测定的吸光度0.819，高于表3的各个实验组。

2.3糯米糠抗氧化肽对羟基自由基和超氧阴离子自由基的清除能力

以米糠为对照，在上述最佳工艺条件下分别制备糯米糠和米糠抗氧化肽，进行羟基自由基和超氧阴离子自由基清除能力实验，结果见图6。

图6　抗氧化肽对羟基和超氧阴离子自由基的清除能力Fig.6　Scavenging activities on·OH and O2-·free radicals ofantioxidant peptide

由图6可知，米糠和糯米糠抗氧化肽对羟基自由基和超氧阴离子自由基的清除率均随用量的增加而增大，存在一定的量效关系，且糯米糠抗氧化肽对羟基和超氧阴离子自由基的清除能力均明显优于米糠抗氧化肽，可能的原因是糯米糠和米糠蛋白在中性蛋白酶水解下产生了不同结构或肽链的活性多肽，导致二者的自由基清除能力出现明显差异。有关糯米糠抗氧化肽的纯化和肽链结构鉴定研究，有待另文进一步报道。

3　结论

综上所述，本文以中性蛋白酶为水解用酶，以抗氧化肽还原力为指标，考察糯米蛋白底物浓度、加酶量、pH、酶解温度、酶解时间等因素对糯米糠抗氧化肽制备效果的影响，采用单因素实验和正交实验优化其制备工艺。结果表明，糯米糠抗氧化肽的最佳制备工艺条件为糯米蛋白底物浓度4%、[E]/[S]2%、pH7、酶解温度40℃、酶解时间6h；在该条件下制备的糯米糠抗氧化肽对羟基自由基和超氧阴离子自由基的清除能力明显优于米糠抗氧化肽，且存在一定的量效关系，提示糯米糠抗氧化肽可用作功能性食品或天然抗氧化剂被深入研究和开发利用。

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[3]徐杰.贵州黑糯米的稻米表皮中有机成分的分离纯化和结构鉴定[J].华南师范大学学报：自然科学版，1996（4）：20-27.

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Study on preparation technology and free radical scavenging capability of antioxidant peptide from glutinous rice bran

LI Li-hua1，YIN Zhong-yi2，ZHENG Xu-xu1，2，*
（1.Environmental and Biological Engineering Institute，Chongqing Technology and Business University，Chongqing 400067，China；2.Chongqing Key Lab of Catalysis&Functional Organic Molecules，Chongqing Technology and Business University，Chongqing 400067，China）

The optimum preparation process of antioxidant peptide from glutinous rice bran and its free radical scavenging capability were studied to exploit and utilize the resources of glutinous rice bran.Neutral protease was selected as hydrolytic enzyme，the single-factor experiment and the orthogonal tests were carried to optimize the preparation process of antioxidant peptide with reducing power of antioxidant peptide to an index. The results showed that the most optimum preparation condition of antioxidant peptides from glutinous rice bran protein with neutral protease were substance concentration 4%，[E]/[S]2%，pH 7，hydrolytic temperature 40℃ and time 6h.The scavenging activities to·OH and O2-·of antioxidant peptide from glutinous rice bran were stronger than which from rice bran，and their concentration and scavenging rate were definite dose-effect relationship，indicating the antioxidant peptide from glutinous rice bran could be used as functional food or natural antioxidants and be in-depth researched and developed and utilized.

glutinous rice bran；antioxidant peptide；enzymolysis；free radical scavenging capability

TS255.1

B

1002-0306（2015）04-0251-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.04.046

2014－06－19

李俐桦（1987-），女，硕士研究生，主要从事废弃生物质资源化利用方面的研究。

郑旭煦（1964-），女，博士，教授，主要从事生物资源与天然药物方面的研究。

重庆市百名学术学科领军人才培养计划（渝教人[2011]60号）。