响应面法优化超临界CO2萃取刺葡萄酒渣中白藜芦醇工艺

刘　婷，王　燕，李　韵，文新昱，欧阳梦云，刘宾翰

（湖南农业大学食品科技学院，湖南长沙410128）

响应面法优化超临界CO2萃取刺葡萄酒渣中白藜芦醇工艺

刘婷，王燕*，李韵，文新昱，欧阳梦云，刘宾翰

（湖南农业大学食品科技学院，湖南长沙410128）

为提高刺葡萄的综合利用价值，以南方“紫秋”刺葡萄酒渣为原料，采用超临界CO2萃取白藜芦醇。在单因素实验基础上，利用响应面法研究了萃取温度、萃取压力、萃取时间及夹带剂用量对白藜芦醇含量的影响，并优化出超临界CO2萃取刺葡萄酒渣中白藜芦醇的最佳工艺条件为萃取温度32℃，萃取压力365bar，萃取时间1.40h，夹带剂用量3.38mL/g，在此条件下白藜芦醇的含量达387.34μg/g，且以反式白藜芦醇苷的形式存在。

刺葡萄酒渣，白藜芦醇，超临界CO2，响应面法

白藜芦醇（resveratrol）是一种含有芪类结构的非黄酮类多酚化合物，自然界中以单体或糖苷的形式存在，具有顺、反式异构体，且反式构象生理活性更为广泛[1]。研究表明，白藜芦醇具有抗肿瘤、抗过敏、抗心血管疾病、抗血小板聚集、抗病原微生物等[2-5]多种生理及药理活性，已被喻为继紫杉醇后又一新的绿色抗癌药物[6-7]。目前已在葡萄科、百合科、豆科、蓼科等21个科、31个属的72种植物中发现白藜芦醇，其中，在葡萄、虎杖、花生中的含量较高[8]。

刺葡萄（V.didii.Foex）是葡萄属东亚群下的一个种，为我国南方主要野生葡萄品种之一。刺葡萄具有高产、味浓、粒小、皮厚、色深等特点，不便作为鲜果食用，但适用于葡萄酒的酿造[9]。在我国，葡萄酒渣往往作为废料被随意丢弃，造成了极大的环境污染和资源浪费，因此从刺葡萄酒渣中开发出有价值的活性物质，对刺葡萄资源的综合利用具有重要意义。

目前，已有从刺葡萄废料中提取植物色素、葡萄籽油等活性物质的研究[10-15]，但从中提取白藜芦醇的研究还鲜见报道。超临界CO2萃取作为一种新型分离技术，具有高效、无毒、环保、操作温度低等优点[16]，将其用于天然产物的萃取，不仅能保持产物的生理活性，而且更符合人们“绿色消费”的观念。本实验采用超临界CO2萃取刺葡萄酒渣中的白藜芦醇，在单因素实验的基础上，采用响应面法对其工艺参数进行研究，以期为南方刺葡萄的综合开发利用提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

刺葡萄酒渣（紫秋刺葡萄） 湖南华淳庄园酒业有限公司；反式白藜芦醇苷标准品（＞98.6%）成都曼思特生物科技有限公司；无水乙醇（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；CO2气体（纯度＞99.9%）长沙高科气体有限公司。

SH10A型水分快速测定仪上海恒平科学仪器有限公司；SFE-2型超临界CO2萃取仪美国Applied Separation公司；Agilent 1100 Series型高效液相色谱仪安捷伦科技有限公司；CP214型电子分析天平奥豪斯仪器（上海）有限公司；DHG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱上海飞越实验仪器有限公司；FW177型中草药粉碎机天津市泰斯特仪器有限公司。

1.2实验方法

1.2.1工艺流程刺葡萄酒渣→50℃烘干（水分含量9.7%）→粉碎→过筛，制成40～60目粉末→准确称取5.00g刺葡萄酒渣粉末→装料→添加夹带剂→超临界CO2静态萃取→分离→白藜芦醇萃取液→定容至30mL→快速滤纸过滤→过0.22μm有机微孔滤膜→待测液→HPLC测定含量。

1.2.2超临界CO2萃取实验设计方法以萃取压力、萃取温度、萃取时间、夹带剂用量为考察因子，以白藜芦醇含量为考察指标进行实验设计，实验选取90%乙醇为夹带剂。

1.2.2.1单因素实验根据预实验及参考文献[17-18]选取单因素实验因素水平，如表1所示。单因素考察时的因素固定水平为：萃取压力300bar，萃取温度40℃，萃取时间1.5h，夹带剂用量2mL/g。

表1　单因素实验因素与水平Table.1　Factors and levels of single factor experiments

1.2.2.2响应面优化实验对单因素实验结果进行显著性分析，选取差异显著的因素作为Box-Behnken实验设计的自变量，以白藜芦醇含量为响应值，通过运用Design-Expert 8.0.5.0软件进行响应面分析及模型的建立，对刺葡萄酒渣中白藜芦醇的超临界CO2静态萃取条件进行优化。响应面实验因素及水平见表2。

表2　响应面分析实验因素水平表Table.2　Factors and levels of RSM test

1.2.3白藜芦醇含量的测定

1.2.3.1色谱条件参照GB/T 15038-2006，最终确定高效液相色谱测定条件为色谱柱：Agilent，ODS C18hypersil（250mm×4.5mm，5μm）；流动相：乙腈+重蒸水=30%+70%；柱温：21℃；流速：1.0mL/min；检测波长：306nm；进样量：10μL；

1.2.3.2标准曲线制作精确称取2.000mg反式白藜芦醇苷标准品于10mL棕色容量瓶中，加乙醇溶解，定容至刻度，得浓度为200μg/mL的反式白藜芦醇苷标准储备液。分别准确吸取0.25、0.5、1、2、4mL于5个不同的10mL棕色容量瓶中，用乙醇定容至刻度，摇匀得5、10、20、40、80μg/mL的反式白藜芦醇苷系列标准液。取10μL在上述色谱条件下进样，以吸收峰面积值（y）为纵坐标，反式白藜芦醇苷浓度（x，μg/mL）为横坐标绘制标准曲线，得回归方程：y=67.4741861x+ 45.87797（R2=0.99937）。

1.2.3.3样品测定吸取待测液10μL，在上述色谱条件下测定，重复3次。用外标法计算出待测液中白藜芦醇的浓度，按下式计算含量：

2　结果与分析

2.1单因素实验

2.1.1萃取压力对白藜芦醇含量的影响由图1可知，固定其他条件，白藜芦醇含量随着萃取压力的升高而增加。当萃取压力在100～300bar范围内，白藜芦醇含量随着萃取压力的升高显著增加，当压力超过300bar后，继续升高压力，白藜芦醇含量的增幅显著减小。这是因为压力越高，CO2密度越大，从而能溶解更多的白藜芦醇，同时，压力升高能有效减少分子间的传质距离，增加传质效率。但随着CO2密度的增大，其可压缩性变小，因而当压力增大到一定程度时，继续增加压力对CO2溶解能力的增加影响变小，甚至可能导致物料部分凝聚而使溶解性下降[19]。随着萃取压力的升高，可萃取物的范围增大，萃取液中非目标物质越多，不利于后续的纯化实验，且过高的压力也会带来安全隐患。故选取300bar为最适萃取压力。

图1　萃取压力对白藜芦醇含量的影响Fig.1　Effect of extraction pressure on resveratrol yield

2.1.2萃取温度对白藜芦醇含量的影响温度对超临界流体萃取的影响主要表现在两方面：一是随着温度的升高，超临界流体的密度减小，溶剂化效应下降，从而使萃取物溶解度降低；二是随着温度的升高，萃取物蒸汽压增大，扩散系数和传质系数增大，有利于萃取的进行[20]。由图2可知，固定其他条件，在温度32～42℃范围内，白藜芦醇含量随萃取温度的升高而降低。白藜芦醇为难挥发的溶质，温度的升高对CO2密度的影响大于对白藜芦醇蒸汽压的影响，因而白藜芦醇含量随萃取温度的升高而降低；另外，越接近临界温度31.2℃，温度的变化对超临界流体密度的影响越大，因此，白藜芦醇含量下降的速度随着温度的升高逐渐变缓。在此单因素实验中，选择32℃为最佳萃取温度。

2.1.3萃取时间对白藜芦醇含量的影响由图3可知，萃取时间小于1.25h时，白藜芦醇含量随着萃取时间的延长而增加，于1.25h达到最大值，继续萃取至1.5h时含量略有下降，再进一步延长萃取时间，白藜芦醇含量急剧下降。这可能是因为长时间的高温、高压条件对白藜芦醇的结构造成了破坏，使已萃取出的白藜芦醇部分分解，有研究者在利用超临界CO2萃取其他多酚物质时也发现了类似现象[21-22]。故选1.25h为最适萃取时间。

2.1.4夹带剂用量对白藜芦醇含量的影响由图4可知，夹带剂用量在1～3mL/g时，白藜芦醇含量随着夹带剂用量的增加而增大，当夹带剂用量大于3mL/g时，白藜芦醇含量随着夹带剂用量的增加反而减少。这是因为夹带剂既能影响超临界流体的密度，又能对溶质在流体中的溶解度产生影响[23]，白藜芦醇含有酚羟基，具有一定的极性，加入适量极性夹带剂乙醇能显著增加白藜芦醇在CO2流体中的溶解度，从而使含量提高，但夹带剂用量过多会导致CO2密度下降，反而使白藜芦醇溶解度降低，另外，过量的夹带剂易导致物料结块，传质阻力加大，也可能是导致白藜芦醇含量降低的原因[24]。故选3mL/g为最适夹带剂用量。

图2　萃取温度对白藜芦醇含量的影响Fig.2　Effect of extraction temperature on resveratrol yield

图3　萃取时间对白藜芦醇含量的影响Fig.3　Effect of extraction time on resveratrol yield

图4　夹带剂用量对白藜芦醇含量的影响Fig.4　Effect of entrainment agent dosage on resveratrol yield

表3　响应面分析实验设计方案及结果Table.3　Experimental design and results for response surface analysis

2.2响应面优化实验

2.2.1响应面分析实验结果对单因素实验结果进行方差分析，得萃取温度、萃取压力、萃取时间、夹带剂用量对白藜芦醇含量均有极显著影响（p＜0.01），因此选取该4个因素为Box-Behnken实验设计的自变量，以白藜芦醇含量为响应值，利用响应面分析法对白藜芦醇的超临界CO2萃取条件进行优化。具体实验方案及结果见表3。

运用软件Design-Expert 8.0.5.0对表3中实验数据进行多元回归分析，经优化得模型方程为：Y= 298.64－52.93A+88.33B+41.10C+28.23D－14.26AB－9.81AC－7.01AD+9.72BC+12.24BD+1.92CD－20.04A2－85.94B2－53.79C2－58.37D2。

对该模型进行方差分析，结果见表4。由表4可知，该模型极显著（p＜0.0001），且模型失拟项不显著（p=0.8915＞0.05），表明模型拟合度较好，残差均由随机误差引起。信噪比（Adeq Precision）为75.099，远大于4，说明该模型可用于实验数据的预测[25]，决定系数R2=0.9980，表明该模型中四因素对白藜芦醇含量的影响占99.80%，调整系数Radj2=0.9960，说明该模型能解释99.60%响应值的变化，预测系数Rpred2=0.9926，可见该模型预测性良好，综上，该模型可用于超临界CO2萃取白藜芦醇实验的分析与预测。在此模型中，萃取温度、萃取压力、萃取时间、夹带剂用量均对白藜芦醇含量有极显著的影响（p＜0.0001），且萃取温度与萃取压力（p=0.0002）、萃取温度与萃取时间（p= 0.0041）、萃取压力与萃取时间（p=0.0043）、萃取压力与夹带剂用量（p=0.0008）之间的交互作用极显著，萃取温度与夹带剂用量（p=0.0279）之间的交互作用显著。根据各因素F值的大小可知，各因素主效应关系为：萃取压力＞萃取温度＞萃取时间＞夹带剂用量。

2.2.2交互作用分析根据回归方程，将其中任意两个因素固定在0水平，即可得体现另外两因素及其交互作用的响应曲面图，见图5～图9。

图5　萃取压力和温度对白藜芦醇提取率影响的响应面Fig.5　Responsive surface and contours of the effect of pressure and temperature on resveratrol yield

由图5可知，固定萃取温度，白藜芦醇含量随着萃取压力的升高而先增加后平缓，且温度较低时的增幅比温度高时的增幅大；在低压条件下，随着温度的升高，白藜芦醇的含量略有下降，但下降幅度较小，在较高压力下，白藜芦醇含量随着温度的升高而大幅度降低。从图5中白藜芦醇含量出现最大值的区域可看出，适当增加萃取压力的同时降低萃取温度有利于白藜芦醇的萃取。由萃取压力与萃取温度相互作用的等高线为椭圆得两者交互作用显著，由沿轴方向等高线变化的密集程度可知，萃取压力主效应大于萃取温度，与上述方差分析结果相符。

表4　响应面结果方差分析Table.4　Variance analysis of response surface results

由图6可知，固定萃取温度，白藜芦醇含量随着萃取时间的延长而增加，且在较低温度下，增幅较大；固定萃取时间，白藜芦醇含量随着萃取温度的增加而降低，且随着时间的延长，下降趋势越明显。由图6中白藜芦醇含量出现最大值的区域可推出，在较低温度下适当延长萃取时间有利于提高白藜芦醇含量。由萃取时间与萃取温度相互作用的等高线为椭圆得两者交互作用显著，与上述方差分析结果相符。

图6　萃取时间和温度对白藜芦醇提取率影响的响应面Fig.6　Responsive surface and contours of the effect of time and temperature on resveratrol yield

由图7可知，固定夹带剂用量，白藜芦醇含量随萃取温度的升高而下降；固定萃取温度，白藜芦醇含量随夹带剂用量的增加先增加后减少。因此，在低温条件下，加入适量夹带剂有利于白藜芦醇的萃取。由夹带剂用量与萃取温度相互作用的等高线为椭圆得两者交互作用显著，与上述方差分析结果相符。

图7　夹带剂用量和温度对白藜芦醇提取率影响的响应面Fig.7　Responsive surface and contours of the effect of entrainment agent dosage and temperature on resveratrol yield

由图8可知，固定萃取时间，白藜芦醇含量随着萃取压力的升高而先增加后趋于平缓；固定萃取压力，白藜芦醇含量随着萃取时间的延长先增加后略有减少。由萃取时间与萃取压力相互作用的等高线为椭圆得两者交互作用显著，由延轴向等高线变化密集程度可知，萃取压力主效应大于萃取时间，与上述方差分析结果相符。

图8　萃取时间和压力对白藜芦醇提取率影响的响应面Fig.8　Responsive surface and contours of the effect of time and pressure on resveratrol yield

由图9可知，固定夹带剂用量，白藜芦醇含量随着萃取压力的增大而增加；固定萃取压力，白藜芦醇含量随着夹带剂用量的增加先增大后下降。由图9中白藜芦醇含量出现最大值的区域可看出，选择剂量合适的夹带剂，增加萃取压力有利于提高白藜芦醇含量。由夹带剂用量与萃取压力相互作用的等高线为椭圆得两者交互作用显著由延轴向等高线变化密集程度可知，萃取压力主效应大于夹带剂用量，与上述方差分析结果相符。

图9　夹带剂用量和压力对白藜芦醇提取率影响的响应面Fig.9　Responsive surface and contours of the effect of entrainment agent dosage and pressure on resveratrol yield

由图10可知，固定夹带剂用量，白藜芦醇含量随萃取时间的延长先增加后略有下降；固定萃取时间，白藜芦醇含量随着夹带剂用量的增加先增后减。因此，过多夹带剂的加入与萃取时间的过分延长都不利于白藜芦醇的萃取，选取合适的萃取时间、加入适当剂量的夹带剂才是高效节能的方法。由夹带剂用量与萃取时间相互作用的等高线接近圆形得两者交互作用不显著，与上述方差分析结果相符。

图10　夹带剂用量和时间对白藜芦醇提取率影响的响应面Fig.10　　Responsive surface and contours of the effect of entrainment agent dosage and time on resveratrol yield

2.2.3白藜芦醇最优萃取条件的确定与验证在各因素选定范围内，利用软件Design-Expert 8.0.5.0对模型进行分析优化，预测出最优萃取条件为萃取温度32℃，萃取压力365.38bar，萃取时间1.38h，夹带剂用量3.38mL/g，在该条件下白藜芦醇含量的预测值为385.51μg/g，考虑到实际操作的便利，将萃取参数修正为萃取温度32℃，萃取压力365bar，萃取时间1.40h，夹带剂用量3.38mL/g，在该条件下进行三次平行验证实验，白藜芦醇的平均含量为387.34μg/g，与理论预测值385.51μg/g相近，说明该响应面模型能准确地优化工艺条件，回归方程具有一定的实验指导意义。

3　结论

在单因素实验基础上，利用响应面法对刺葡萄酒渣中白藜芦醇的超临界CO2萃取工艺进行优化，建立了白藜芦醇含量与萃取温度、萃取压力、萃取时间及夹带剂用量四因素的多项式回归模型，通过验证实验证明该模型是科学可靠的。经分析得出，各因素对白藜芦醇萃取含量影响的主次顺序为：萃取压力＞萃取温度＞萃取时间＞夹带剂用量，同时，由多元回归方程得出超临界CO2萃取刺葡萄酒渣中白藜芦醇的最优工艺为：萃取温度32℃，萃取压力365bar，萃取时间1.40h，夹带剂用量3.38mL/g，在该条件下，白藜芦醇（以反式白藜芦醇苷的形式存在）含量为387.34μg/g，与预测值相近，且高于任何一次单因素实验，证明优化得到的提取工艺合理可靠。

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Optimization of supercritical CO2extraction of resveratrol from V.didii.Foex fruit wine residues by response surface methodology

LIU Ting，WANG Yan*，LI Yun，WEN Xin-yu，OUYANG Meng-yun，LIU Bin-han
（College of Food Science and Technology，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China）

In order to improve comprehensive utilization of V.didii.Foex，the resveratrol from V.didii.Foex fruit wine residues was extracted by supercritical fluid extraction.Based on single factor experiments，response surface methodology was adopted to investigate the effects of extraction temperature，extraction pressure，extraction time and entrainment agent dosage on resveratrol yield.The optimal extraction conditions were as follows：extraction temperature 32℃，extraction pressure 365bar，extraction time 1.40h and entrainment agent dosage 3.38mL/g.Under these conditions，the yield of resveratrol was 387.34μg/g，and mainly in the form of trans-piceid.

V.didii.Foex fruit wine residues；resveratrol；supercritical CO2；response surface methodology

TS255.1

B

1002-0306（2015）04-0193-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.04.034

2014－06－20

刘婷（1990-），女，硕士研究生，研究方向：食品化学与营养。

王燕（1968-），女，博士，教授，研究方向：食品化学与营养。

湖南省大学生研究性学习和创新性实验计划项目（DFCXS201302）。