浙贝母抑制耐药肿瘤P糖蛋白的活性组分研究

刘韦鋆，邹富胜，李东华

浙贝母抑制耐药肿瘤P糖蛋白的活性组分研究

刘韦鋆，邹富胜，李东华

目的：阐明浙贝母抑制耐药肿瘤细胞P-糖蛋白（P-gp）的活性组分。方法：利用回流提取法通过树脂纯化技术，制备浙贝母总生物碱、总核苷、总多糖。建立HepG2/mdr细胞株。利用Calcein-AM试剂盒HepG2/mdr细胞摄取实验对浙贝母总生物碱、总核苷、总多糖进行P-gp潜在抑制剂的筛选。结果：制备的浙贝母总生物碱、总核苷、总多糖含量为51.45%、47.84%、23.78%。HepG2/mdr细胞株P-gp的相对蛋白表达为(26.22±1.09)，极显著高于亲本HepG2细胞株(8.91±2.00)（P＜0.01）。阳性对照组Calcein荧光比率为(173.96±12.87)%，极显著高于空白组(100.00±11.49)%（P＜0.01）。浙贝母总生物碱、总核苷低剂量组Calcein荧光比率为(134.96±11.91)%、(126.89±10.42)%，显著高于空白组(100.00±11.49)%（P＜0.05）。浙贝母总生物碱、总核苷高剂量组Calcein荧光比率为(209.72±9.44)%、(162.42±7.83)%，极显著高于空白组(100.00±11.49)%（P＜0.01）。浙贝母总多糖低、高剂量组与空白组无显著差异。结论：HepG2/mdr细胞株表现出耐药性，阳性抑制剂抑制P-gp的外排活性；浙贝母总生物碱、总核苷抑制P-gp的外排活性，呈现浓度依赖性。

浙贝母；P-糖蛋白；肿瘤耐药；活性组分

恶性肿瘤化疗效果欠佳，一个重要的原因就是肿瘤对化疗药物的多药耐药性[1]。肿瘤多药耐药性是指肿瘤细胞对多种化学结构不同、作用机理各异的药物交叉耐受的性质[2]。由MDR1基因编码的P-糖蛋白（P-glycoprotein,P-gp）属于能量依赖型外排泵[3]。耐药肿瘤细胞过度表达P-gp[4]，主要作用是将底物类化疗药物排出细胞外，减弱治疗效果。因此，P-gp已成为肿瘤耐药性治疗的重要靶点。

P-gp抑制剂抑制P-gp外排活性，使化疗药物聚集于肿瘤细胞，对抗肿瘤耐药性[5]。随着发展，其P-gp亲和力逐渐增强，毒性逐渐降低[6]。近年来出现一类新的P-gp抑制剂，为传统中药[7-8]。由于其显著的低毒性，被作为理想的P-gp抑制剂。浙贝母味苦，性寒，归肺、心经。化痰止咳，清热散结。临床研究发现[9-10]浙贝母能逆转肿瘤耐药性，其机制在于抑制耐药肿瘤细胞的P-gp活性。但这种作用基于何种活性组分，尚缺乏全面统一的说法。本研究旨在筛选浙贝母抑制耐药肿瘤细胞P-gp的活性组分。

1　材料与方法

1.1细胞人肝癌细胞HepG2，由天津中医药大学提供。

1.2仪器旋转蒸发器（RE-52AA型，中国上海振捷实验设备有限公司）；紫外可见分光光度计（U2800型，日本日立公司）；高速离心机（Avanti J-30I型，美国BECKMAN公司）；生物安全柜（MSC-ADVANTAGE 1.2型，美国Thermo公司）；CO2培养箱（311型，美国Thermo公司）；倒置显微镜（DM14000B型，德国Leica公司）；垂直电泳仪，转膜仪，电源（Sub-Cell型，美国伯乐公司）；全自动多功能化学发光分析系统（Chemi Doc XRS 170-8071型，美国伯乐公司）；荧光/化学发光检测仪（Fluoroskan Ascent FL型，美国Thermo公司）

1.3药材及试剂浙贝母饮片，由天津中医药大学提供，并鉴定为合格；贝母乙素、腺苷（50 mg，中国南京泽朗有限公司）；葡萄糖（500 g，中国天津大学科威公司）；阿霉素、维拉帕米（25 mg，美国SIGMA公司）；D101大孔吸附树脂（500 g，中国天津市海光化工有限公司）；732阳离子交换树脂（500 g，中国天津市海光化工有限公司）；95%乙醇（500 mL，中国天津康科德公司）；DMSO（100 mL，美国SIGMA公司）；PBS溶液（500 mL，美国cellgro公司）；DMEM培养基、胎牛血清（500 mL，美国gibco公司）；双抗（100 mL，美国Hyclone公司）；EDTA、胰蛋白酶（100 mg，美国SIGMA公司）；Western Blot主要相关试剂（美国SIGMA公司）；Calcein-AM试剂盒（4892-010-K型，美国Trevigen公司）

1.4浙贝母主要组分的制备称取浙贝母，加入8倍量75%乙醇回流提取。提取液浓缩后，通过D101型大孔吸附树脂，依次用3倍量蒸馏水洗，用5倍量30%乙醇洗脱，用8倍量95%乙醇洗脱，收集95%乙醇洗脱液，浓缩后，通过732型阳离子交换树脂，依次用3倍量蒸馏水洗，用5倍量0.5 mol/L醇氨洗脱，收集0.5 mol/L醇氨洗脱液，浓缩，干燥，即得浙贝母总生物碱，以酸性染料比色法测定其含量。称取浙贝母，加入8倍量蒸馏水回流提取。提取液浓缩后，加95%乙醇至乙醇浓度为70%，沉淀24 h，过滤，沉淀物干燥，即得浙贝母总多糖，以蒽酮硫酸比色法测定其含量。醇沉上清液浓缩后，通过D101型大孔吸附树脂，依次用3倍量蒸馏水洗，用5倍量30%乙醇洗脱，收集30%乙醇洗脱液，浓缩后，通过732型阳离子交换树脂，用3倍量蒸馏水洗，收集流出液和蒸馏水洗脱液，合并浓缩，干燥，即得浙贝母总核苷，以紫外分光光度法测定其含量。

1.5HepG2细胞株的培养复苏后的HepG2细胞置于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，在37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养，每周传代2～3次，倒置显微镜下观察细胞生长状况。

1.6HepG2/mdr细胞株的建立取对数生长期的HepG2细胞，分别加入倍比稀释的阿霉素，37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养48 h，更换无阿霉素的培养液，筛选耐药成活细胞，继续培养，待细胞增值恢复至原有水平时，阿霉素浓度加倍，重复上述步骤，直到细胞能完全生长在2000 nmol/L浓度下，即获得耐药细胞株HepG2/mdr，并利用Western Blot技术检测P-gp表达，与HepG2细胞株进行统计学分析加以验证。取对数生长期的HepG2/mdr细胞用于试验。

1.7HepG2/mdr细胞摄取考察

1.7.1Calcein-AM试剂盒实验Calcein-AM试剂盒可用于P-gp抑制剂的高通量筛选。该试剂盒快速，灵敏，操作简单，无需HPLC等检测手段，明显优于传统细胞摄取实验。实验分组为空白组，P-gp阳性抑制剂维拉帕米组，5μg/mL总生物碱、总核苷、总多糖给药组，50μg/mL总生物碱、总核苷、总多糖给药组，每组3个平行。HepG2/mdr细胞种于96孔黑色不透明板中，培养48 h。用预热的PBS清洗2次，加入100μL待测试药物（空白组加入100μL培养基），再加入50μL培养基，使体积达到150μL，预孵育10 min。用PBS将1 mmol/L的Calcein-AM稀释至1μmol/L（现配现用）。加入50μL Calcein-AM（终浓度0.25μmol/L），37℃孵育1 h。用冰冷的PBS终止反应，并清洗2次，然后加入100μL 0.1% Triton-100，增加细胞通透性。利用荧光/化学发光检测仪于EX=494 nm，EM=517 nm处，检测荧光值。

1.7.2数据处理荧光比率=实验组荧光值/空白组荧光值×100%

2　结果

2.1浙贝母主要组分的含量浙贝母总生物碱含量为51.45%，且检测不到总核苷和总多糖杂质。浙贝母总核苷含量为47.84%，且检测不到总生物碱和总多糖杂质。浙贝母总多糖含量为23.78%，且检测不到总核苷和总生物碱杂质。

2.2HepG2/mdr细胞株的P-gp鉴定HepG2/mdr细胞株P-gp的相对蛋白表达为(26.22±1.09)，HepG2细胞株P-gp的相对蛋白表达为(8.91±2.00)，经独立样本t检验，两组细胞具有极显著差异（P＜0.01）。如图1所示。

图1　HepG2/mdr细胞株的P-gp表达(n=3)

2.3浙贝母主要组分的P-gp潜在抑制活性在HepG2/mdr细胞中，P-gp阳性抑制剂维拉帕米组Calcein的荧光比率为(173.96±12.87)%，空白组Calcein的荧光比率为(100.00±11.49)%，经独立样本t检验，该阳性对照组与空白组具有极显著差异（P＜0.01）。浙贝母总生物碱、总核苷低剂量组Calcein的荧光比率分别为(134.96±11.91)% 、(126.89± 10.42)%，空白组Calcein的荧光比率为(100.00± 11.49)%，经独立样本t检验，两实验组与空白组具有显著差异（P＜0.05）。浙贝母总生物碱、总核苷高剂量组Calcein的荧光比率为(209.72±9.44)%、(162.42±7.83)%，空白组Calcein的荧光比率为(100.00±11.49)%，经独立样本t检验，两实验组与空白组具有极显著差异（P＜0.01）。浙贝母总多糖低、高剂量组Calcein的荧光比率为(83.44±6.32)%、(87.78±3.10)%，空白组Calcein的荧光比率为(100.00±11.49)%，经独立样本t检验，两实验组与空白组无显著差异。如图2所示。

图2　浙贝母主要组分对HepG2/mdr细胞Calcein-AM摄取的影响（n=3）

3　讨论

浙贝母为百合科贝母属植物浙贝母的干燥鳞茎，为传统中药之一，始载于《神农本草经》。同时浙贝母也是传统的食疗佳品，体现了中医强调的药食同源，如贝母梨、猪肺贝母汤、雪梨贝母粥、大贝母酒等。浙贝母的主要组分为总生物碱类、总核苷类和总多糖类[11-13]。其中，浙贝母中总生物碱和总核苷的含量较高，成分也较为复杂。而浙贝母总生物碱中所占比例最大的成分为贝母甲素、贝母乙素和贝母辛[14]。浙贝母总核苷中主要成分有腺苷、尿苷和鸟苷[15]。

浙贝母的传统药理作用主要包括平喘、镇咳、祛痰、镇静、镇痛、降血压、抑制中枢、抑菌、抗溃疡、抗血小板聚集等[16]。但近年来的临床文献表明[9-10]，浙贝母及其制剂抑制P-gp的外排活性，进而逆转肿瘤细胞的多药耐药性。这也是浙贝母一个新的潜在药理作用。本实验深入研究产生这种作用的活性组分。首先，通过提取纯化技术得到的浙贝母总生物碱、总核苷、总多糖。根据其含量计算Calcein-AM试剂盒实验中待测药物的浓度。建立HepG2/mdr细胞株，并经P-gp表达鉴定。HepG2/mdr细胞株P-gp的表达量极显著高于亲本HepG2细胞株，表明所建立的HepG2/mdr细胞株表现出耐药性。该细胞株建立成功。利用Calcein-AM试剂盒HepG2/ mdr细胞摄取实验筛选P-gp潜在抑制剂。阳性对照组Calcein摄取量极显著高于空白组，说明这种抑制剂抑制P-gp的外排活性，该试剂盒研究方法可靠。浙贝母总生物碱、总核苷低剂量组Calcein摄取量显著高于空白组。浙贝母总生物碱、总核苷高剂量组Calcein摄取量极显著高于空白组。这表明浙贝母总生物碱、总核苷抑制P-gp的外排活性，呈现浓度依赖性。而浙贝母总多糖低、高剂量组与空白组无显著差异，表明浙贝母总多糖与P-gp不存在相互作用。因此，浙贝母抑制耐药肿瘤细胞P-gp的活性组分为浙贝母总生物碱、总核苷，而这两种活性组分的起效成分有待进一步研究。本研究为新型P-gp抑制剂的开发提供数据支持，为浙贝母新药效的研究提供实验基础，为临床耐药肿瘤治疗发展新的干预手段提供科学参考。

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（收稿：2015-06-06修回：2015-07-12）

（责任编辑刘洪斌）

Studies on P-glycoprotein Inhibitor of Multidrug Resistant Tumor in Bulbus Fritillariae Thunbergii

LIU Wei-jun,ZOU Fu-sheng,LI Dong-hua.Tianjin Nankai Hospital,Tianjin(300100),China

ObjectiveTo clarify P-glycoprotein(P-gp)inhibitor of multidrug resistant tumor in Bulbus Fritillariae Thunbergii.MethodsAlkaloid,nucleoside and polysaccharide from Bulbus Fritillariae Thunbergii were got by reflux method and resin purification technology.HepG2/mdr cell line was established.The potential P-gp inhibitor on alkaloid,nucleoside and polysaccharide from Bulbus Fritillariae Thunbergii was screened by cellular uptake using the Calcein-AM Kit.ResultsThe contents of preparative alkaloid,nucleoside and poly⁃saccharide from Bulbus Fritillariae Thunbergii were 51.45%,47.84%and 23.78%alternatively.The relative pro⁃tein express of HepG2/mdr was(26.22±1.09),very significantly higher than that of HepG2(8.91±2.00)(P＜0.01).The Calcein fluorescence percentage of positive group was(173.96±12.87)%,very significantly higher than that of the control group(100.00±11.49)%(P＜0.01).The Calcein fluorescence percentages of low-dose alka⁃loid group and nucleoside group were(134.96±11.91)%and(126.89±10.42)%,significantly higher than those of the control group(100.00±11.49)%(P＜0.05).The Calcein fluorescence percentages of high-dose alkaloid group and nucleoside group were(209.72±9.44)%and(162.42±7.83)%,very significantly higher than those of the control group(100.00±11.49)%(P＜0.01).The Calcein fluorescence percentage of polysaccharide group had no significant differences from that of the control group.ConclusionEstablished HepG2/mdr shows multi⁃drug resistance;the positive inhibitor inhibits P-gp efflux activity;alkaloid and nucleoside from Bulbus Fritillari⁃ae Thunbergii inhibit P-gp efflux activity and show concentration dependence.

Bulbus Fritillariae Thunbergii;P-glycoprotein;tumor multidrug resistance;active component

R730.1

A

1007-6948(2015)04-0379-04

10.3969/j.issn.1007-6948.2015.04.013

天津市南开医院药理室（天津市 300100）

邹富胜，E-mail:zoufs@sina.com