李柱来,张春玲,杨 州,朱文山,王 艰,许秀枝
喹喔啉是由苯环与吡嗪拼合而成的含氮杂环类化合物,喹喔啉环作为蝶啶和喹唑啉环的生物电子等排体,目前蝶啶和喹唑啉环最有代表性的药物有甲氨蝶呤、曲美沙特、拓优得等[1-2]。喹喔啉及其衍生物与ATP结构中的碱基腺嘌呤互为电子等排体,而ATP是PTK催化各种蛋白酪氨酸激酶受体磷酸化的磷酸根供体。该类化合物通过拮抗酪氨酸激酶的活性,从而阻断其磷酸化过程,使生物细胞内的信号传导过程不能正常进行,从而影响细胞的增殖、迁移、分化,尤其是癌变细胞;此类化合物作为信号通路的阻断剂,在抗肿瘤靶向新药设计中备受关注。2000年至今已有十多个小分子酪氨酸激酶抑制剂类药物上市用于肿瘤的靶向治疗[3-4]。本研究利用生物电子等排体和拼合原理,通过O、S键的连接将喹喔啉环与吡啶、嘧啶等芳香杂环进行拼合生成双芳香环的新型化学实体(图1),并采用 MTT法进行初步体外抗肿瘤活性研究,以期开发出新一类特异性高、毒副作用小、耐受性好的新型抗肿瘤药物。
1.1 材料
1.1.1 主要仪器 集热式磁力恒温搅拌器(DF-1,金坛市江南仪器厂);三用紫外线分析仪(ZF-I型,上海顾村电光仪器厂);数字熔点仪(WRS-1B,上海精密科学仪器有限公司);红外光谱仪(Avatar 330 FT-IR,美国 Thermo Nicolet公司);核磁共振仪(AVANCEⅢ,德国Bruker Biospin公司)。抗肿瘤细胞增殖实验所用仪器参照文献[5]。
1.1.2 主要试剂 4-甲基邻苯二胺、4-氯邻苯二胺、4-羟基苯甲醛为阿拉丁分析纯,草酸二乙酯为上海迈瑞尔化学技术有限公司分析纯,三氯氧磷为北京鑫鼎腾飞技术发展有限公司分析纯,3-羟基吡啶为南京诚杰化工有限公司分析纯,2-巯基嘧啶、2-巯基-4,6-二甲氧基嘧啶为江苏鸿泰化工有限公司分析纯,2-巯基-4,6-二甲基嘧啶为金坛市合恩泰化工有限公司分析纯,其余试剂均为国药集团化学试剂有限公司分析纯;柱层析硅胶(青岛海洋化工厂),未经活化;TLC硅胶铝板(德国 Merck KGaA 64271 Darmstadt公司);肿瘤细胞株SGC-7901和HepG2由福建医科大学药理学研究所传代培养。抗肿瘤细胞增殖实验所用试剂参照文献[5]。
1.2 合成方法
1.2.1 2,3-二氯喹喔啉中间体的合成
1.2.1.1 6-氯喹喔啉-2,3-(1H,4H)-二酮(1c)和6-甲基喹喔啉-2,3-(1H,4H)-二酮(1m) 在250mL三口烧瓶中加入4-氯邻苯二胺/4-甲基邻苯二胺(0.133 3mol)、草酸二乙酯18.2mL(0.133 7mol)和4mol/L的HCl 100mL,磁力搅拌下、80℃水浴加热回流反应2h。反应液冷却至室温,析出固体。抽滤,水洗,干燥得产物。1c:浅灰色固体,产率83.3%,mp>300℃。IR(KBr,cm-1):3 453(s),3 061(w),2 841(w),1 695(s),1 618(s),1 392(m),1 229(m),858(s);1H-NMR(400MHz,CDCl3,δ):11.93(d,2H),8.06(t,2H),7.64(d,1H)。1m:白色蓬松固体,产率89.6%,mp>300℃。IR(KBr,cm-1):3 472(s),2 854(w),1 697(s),1 534(s),1 394(m),1 136(s),807(s),691(w);1H-NMR(400MHz,CDCl3,δ):11.80(d,2H),7.03(d,2H),6.92(s,1H),2.50(t,3H)。
图1 6-氯/甲基-2/3-芳基喹喔啉衍生物合成路线Fig 1 Synthetic of 6-chloro/methyl-2/3-arylquinoxaline derivatives
1.2.1.2 2,3,6-三氯喹喔啉(2c)和6-甲基-2,3-二氯喹喔啉(2m) 在250mL干燥三口烧瓶中加入化合物(1c)/(1m)(0.100 7mol)、POCl3120mL 和DMF 5~6mL,搅拌固体缓慢溶解,110℃加热反应2h。反应液冷却至室温,将其慢慢倒入1 200mL冰水中,产生烟雾并急剧放热,析出大量灰白色固体,静置1h。抽滤,滤饼用水洗涤至中性,粗产物用乙醇/乙酸乙酯混合溶剂重结晶,活性炭脱色,析出白色沉淀,抽滤,干燥得产物。2c:白色固体,产率58.9%,mp 145.5~145.9℃。IR(KBr,cm-1):1 598,1 469,1 283,1 249,1 159,1 008,888,832;1H-NMR (400MHz,CDCl3,δ):8.05(q,1H),7.98(d,1H),7.76(d,1H)。2m:白色蓬松固体,产率80.0%,mp 114.4~114.9℃。IR(KBr,cm-1):3 066(s),2 951(s),1 621(s),1 526(m),1 453(s),1 258(s),996(s),826(m);1H-NMR(400MHz,CDCl3,δ):7.92(d,1H),7.79(s,1H),7.65(d,1H),2.77(s,1H),2.61(s,1H),2.45(s,1H)。
1.2.2 6-氯/甲基-2/3-芳基喹喔啉衍生物的合成
1.2.2.1 4-(2,6-二 氯 喹 喔 啉-3-氧 基 )苯 甲 醛(3c-1),4-(2,7-二氯喹喔啉-3-氧基)苯甲醛(3c-2),4-(2-氯-6-甲 基 喹 喔 啉-3-氧 基 )苯 甲 醛 (3m-1)和4-(2-氯-7-甲基喹喔啉-3-氧基)苯甲醛(3m-2) 中间体(2c)/(2m)(0.004mol)、4-羟基苯甲醛0.488g(0.004mol),无水 K2CO30.556g(0.004mol)和20mL DMF,室温搅拌反应3~4h。将反应液倒入冰水中,静置,析出固体。抽滤,水洗滤饼,干燥,所得粗产物上柱,用乙酸乙酯/石油醚(1∶5)并逐渐增大极性进行洗脱。3c-1:白色蓬松固体,产率42.0%,mp 175.7~175.9 ℃,IR(KBr,cm-1):2 921(s),1 916(s),1 698(s),1 400(s),1 332(s),1 214(s),1 158(w),1 068(w),867(m);1H-NMR(400MHz,CDCl3,δ):10.09(s,1H),8.04(d,2H),7.95(d,1H),7.77(s,1H),7.63(d,1H),7.50(d,2H)。3c-2:乳白色固体,产率8.1%,mp 179.3~180.2℃,IR(KBr,cm-1):2 819(w),2 352(w),1 700(w),1 573(s),1 445(m),1 328(s),1 211(s),1174(s),827(m);1H-NMR(400MHz,CDCl3,δ):10.09(s,1H),8.07(d,2H),7.75(s,1H),7.64(d,1H),7.51(t,3H)。3m-1:白色蓬松固体,产率69.0%,mp 136.2~142.2 ℃,IR(KBr,cm-1):3 056(s),2 738(s),1 700(s),1 602(m),1 500(s),1 330(s),1 066(s),863(m),825(m);1H-NMR(400MHz,CDCl3,δ):10.01(s,H),8.05(d,2H),7.98(t,1H),7.51(m,4H),2.54(d,3H)。3m-2:乳白色固 体,产 率 6.9%,mp 189.3 ~190.6℃,IR(KBr,cm-1):2 921(s),2 737(s),1 700(m),1 422(s),1 332(s),1 212(s),865(m),829(m);1H-NMR(400MHz,CDCl3,δ):10.08(s,1H),8.04(d,2H),7.56(m,4H),7.43(t,1H),2.51(s,3H)。
1.2.2.2 3-(吡啶-3-氧基)-2,6-二氯喹喔啉(4c-1),2-(吡啶-3-氧基)-3,6-二氯喹喔啉(4c-2)和6-甲基-3-(吡啶-3-氧基)-2-氯喹喔啉(4m-1) 合成方法同3c-1(2),用3-羟基吡啶代替4-羟基苯甲醛进行反应。4c-1:白色蓬松固体,产率41.3%,mp 151.3~151.6℃,IR(KBr,cm-1):3 031(w),1 604(s),1 400(m),1 330(m),1 211(s),1 071(s),825(m),700(m);1H-NMR(400MHz,CDCl3,δ):8.67(s,1H),8.62(s,1H),7.97(d,1H),7.76(s,1H),7.70(d,1H),7.64(d,1H),7.48(s,1H)。4c-2:乳白色固体,产率7.6%,mp 157.5~159.6℃,IR(KBr,cm-1):3 068(w),1 604(s),1 403(m),1 318(m),1 214(s),1 078(s),833(m),808(m);1H-NMR(400MHz,CDCl3,δ):8.69(s,1H),8.62(d,1H),8.02(s,1H),7.98(s,1H),7.67(d,1H),7.64(s,1H),7.49(d,1H)。4m-1:粗产物用乙醇重结晶,得乳白色晶体,产率53.1%,mp 131.4~132.7 ℃。IR(KBr,cm-1):3 035(s),1 621(m),1 552(s),1 477(s),1 328(s),1 213(s),1 066(s),829(m),705(s);1H-NMR(400MHz,CDCl3,δ):8.68(s,2H),8.60(d,1H),7.91(d,1H),7.70(d,1H),7.55(m,2H),2.53(t,3H)。
1.2.2.3 3-(嘧啶-2-巯基)-2,6-二氯喹喔啉(5c-1),2-(嘧啶-2-巯基)-3,6-二氯喹喔啉(5c-2)和6-甲基-3-(嘧啶-2-巯基)-2-氯喹喔啉(5m-1) 合成方法同3c-1(2),用2-巯基嘧啶代替4-羟基苯甲醛进行反应。5c-1:白色晶体,产率 21.7%,mp 139.8~140.6℃。IR(KBr,cm-1):2 923,1 604,1 554,1 380,1 125,1 008,921,836;1H-NMR(400MHz,CDCl3,δ):8.63(d,2H),8.03(t,2H),7.77(d,1H),7.19(t,1H)。5c-2:淡黄色固体,产率6.5%,mp>300 ℃,IR(KBr,cm-1):2 922(w),1 596(s),1 557(s),1 384(m),1 125(s),1 000(s),921(s),832(m);1H-NMR(400MHz,CDCl3,δ):8.60(d,2H),8.06(s,2H),8.02(d,1H),7.17(t,H)。5m-1:粗产物用乙醇重结晶,得浅黄色晶体,产率35.4%,mp>300 ℃。IR(KBr,cm-1):3 056(s),1 621(m),1 553(s),1 380(s),1 122(s),1 000(s),830(m),744(m);1H-NMR(400MHz,CDCl3,δ):8.56(s,2H),7.97(dd,1H),7.84(s,1H),7.66(dd,1H),7.13(t,1H),2.62(s,3H)。
1.2.2.4 3-(4,6-二甲基嘧啶-2-巯基)-2,6-二氯喹喔啉(6c-1),2-(4,6-二甲基嘧啶-2-巯基)-3,6-二氯喹喔 啉 (6c-2)和 6-甲 基-3-(4,6-二 甲 基 嘧 啶-2-巯基)-2-氯喹喔啉(6m-1) 合成方法同3c-1(2),用4,6-二甲基-2-巯基嘧啶代替4-羟基苯甲醛进行反应。6c-1:红色固体,产率34.5%,mp>300 ℃,IR(KBr,cm-1):3 033(w),1 642(s),1 583(m),1 261(s),1 124(s),1 008(s),923(s),836(m);1H-NMR(400MHz,CDCl3,δ):7.98(d,2H),7.73(d,1H),6.94(s,1H),2.44(s,6H)。6c-2:红 色 固 体,产 率 9.2%,mp>300 ℃,IR(KBr,cm-1):3 033(w),1 693(m),1 585(s),1 243(s),1 149(s),1 122(s),1 012(s),927(s),836(m);1H-NMR(400MHz,CDCl3,δ):8.04(s,1H),7.98(d,1H),7.73(d,1H),6.89(s,1H),2.41(s,6H)。6m-1:粗产物用乙醇重结晶,得米白色晶体,产率36.2%,mp>300℃。IR(KBr,cm-1):3 027,2 921(s),1 740(m),1 619(s),1 583(s),1 244(s),1 127(s),998(s),829(m);1H-NMR(400MHz,CDCl3,δ):7.95(t,1H),7.82(s,1H),7.63(t,1H),6.86(d,1H),2.60(d,3H),2.38(d,6H)。
1.2.2.5 3-(4,6-二甲氧基嘧啶-2-巯基)-2,6-二氯喹喔啉(7c-1)和6-甲基-3-(4,6-二甲氧基嘧啶-2-巯基)-2-氯喹喔啉(7m-1) 合成方法同3c-1(2),用4,6-二甲氧基-2-巯基嘧啶代替4-羟基苯甲醛进行反应。粗产物用乙醇重结晶。7c-1:浅亮黄色晶体,产率 42.2%,mp 138.2~140.0 ℃。IR(KBr,cm-1):2 988(w),1 754(s),1 589(m),1 374(s),1 268(s),1 189(s),923(s),830(m);1H-NMR(400MHz,CDCl3,δ):8.05(dd,2H),7.79(d,1H),5.85(s,1H),3.72(s,6H)。7m-1:白色晶体,产率52.8%,mp 148.9~152.4℃。IR(KBr,cm-1):2 952(w),1 621(s),1 558(s),1 376(s),1 212(w),998(m),815(m);1H-NMR(400MHz,CDCl3,δ):7.94(m,2H),7.66(t,1H),5.80(s,1H),3.69(s,6H),2.62(d,3H)。
1.3 抗肿瘤活性 采用MTT法检测15个6-氯/甲基-2/3-芳基喹喔啉衍生物(3c-1~7m-1)对SGC-7901及HepG2细胞株的体外细胞毒作用。人胃癌SGC-7901细胞和人肝癌HepG2细胞培养于10%胎牛血清 RPMI-l640的培养液中,并加入100U/mL链霉素和10μg/mL青霉素,在维持细胞分裂生长状态下,将细胞接种在25mL的培养瓶中,放在37℃、体积分数为0.95的空气培养箱中培养,每2~3d换1次培养液,待瓶中细胞长满以后,再进行传代冻存。收集对数期SGC-7901及HepG2细胞,调整细胞悬液浓度,每孔加100μL,铺板使待测SGC-7901及 HepG2细胞密度分别为每孔10 000,7 000个。
实验分对照组和目标化合物组。对照组10孔,每孔加培养液100μL;目标化合物组加入7种不同浓度梯度的6-氯/甲基-2/3-芳基喹喔啉衍生物,每孔100μL,设3个复孔,同时设置调零孔。放置于体积分数为0.05的CO2、37℃培养箱中,培养48h,倒置显微镜下观察,每孔加入20μL MTT溶液,在37℃下继续培养4h,终止培养,弃去培养液,每孔加150μL二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10min,使结晶物充分溶解,在酶联免疫检测仪570nm处测量各孔的吸光度[6-7]。
2.1 合成经环合、氯代、亲核取代反应 此次共合成15个新的6-氯/甲基-2/3-芳基喹喔啉衍生物。4-氯/甲基邻苯二胺与草酸二乙酯缩合生成内酰胺,产率比与草酸反应高。4-氯/甲基邻苯二胺与草酸二乙酯进行环合生成的6-氯/甲基喹喔啉-2,3(1H,4H)-二酮(1c,1m),内酰胺化合物(1c,1m)可以互变异构为6-氯/甲基喹喔啉-2,3-二醇,该中间体易与三氯氧磷进行氯代反应生成2,3,6-三氯喹喔啉(2c)和2,3-二氯-6-甲基喹喔啉(2m)。化合物(2c,2m)环上的氯原子是很好的离去基团,受相邻氯原子的影响使其活性增强,在室温条件下可以和羟基(巯基)吡啶、嘧啶等进行亲核取代反应。目标产物的合成,以DMF为溶剂、无水K2CO3为缚酸剂,将吡啶、嘧啶等芳香杂环通过O、S与喹喔啉环相连,形成新的化合物。所得产物存在几何异构体,通过柱层析进行分离,异构体间极性差异小,用乙酸乙酯/石油醚(1∶9)才能得以较好的分离。
2.2 目标化合物对SGC-7901和HepG2细胞株的体外抗肿瘤活性 喹喔啉类衍生物对癌细胞增殖抑制作 用 见 表 1。6-氯-2/3-芳 基 喹 喔 啉 衍 生 物 对SGC-7901和HepG2细胞增殖抑制作用多数大于6-甲基-2/3-芳基喹喔啉衍生物,6位上引入吸电子基团可以增加该类化合物的抗肿瘤活性。6-氯/甲基-2/3-芳基喹喔啉衍生物对人胃癌SGC-7901细胞的抑制效果较人肝癌 HepG2细胞好,其中6-氯-2/3-芳基喹喔啉衍生物(5c-1)和6-甲基-2/3-芳基喹喔啉衍生物(7m-1)对SGC-7901细胞增殖抑制IC50值分别为2.02和0.001 6μg/mL。7m-1是4,6-二甲氧基嘧啶通过S原子与6-甲基喹喔啉环相连,嘧啶环上甲氧基有强的给电子能力,通过共轭效应影响目标化合物的电荷分布及空间形态,可能提高了目标化合物与受体的亲合能力,该化合物对肿瘤细胞的增殖抑制活性高,可作为进一步研究开发的重点。
表1 目标化合物对SGC-7901和HepG2细胞株的半数抑制浓度Tab 1 IC50of target compounds for SGC-7901and HepG2 cell lines μg/mL
合成得到15个6-氯/甲基-2/3-芳基喹喔啉衍生物。这2类化合物,对SGC-7901和HepG2肿瘤细胞抑制作用较强,6-氯-2/3-芳基喹喔啉衍生物抗肿瘤活性多数大于6-甲基-2/3-芳基喹喔啉衍生物,其中6-氯-2/3-芳基喹喔啉衍生物(5c-1)和6-甲基-2/3-芳基喹喔啉衍生物(7m-1)对SGC-7901肿瘤细胞增殖抑制活性好,可以进行结构优化,以期开发毒副作用小、耐受性好的新型抗肿瘤药物。
[1]Khier S,Deleuze-Masquéfa C,Moarbess G,etal.Pharmacology of EAPB0203,a novel imidazo[1,2-a]quinoxaline deriva-tive with anti-tumoral activity on melanoma[J].EurJPharm Sci,2010,39(1-3):23-29.
[2]Marverti G,Ligabue A,Paglietti G,etal.Collateral sensitivity to novel thymidylate synthase inhibitors correlates with folate cycle enzymes impairment in cisplatin-resistant human ovarian cancer cells[J].EurJPharmacol,2009,615(1-3):17-26.
[3]周冰莹,安春娜,蒲小平.酪氨酸激酶抑制剂类新药的研发现状[J].中国新药杂志,2011,20(17):1661-1666.
[4]赵迎春,张前军,卢永仲,等.小分子蛋白酪氨酸激酶抑制剂的合成研究进展[J].化学研究,2014,25(4):428-440.
[5]张春玲,许秀枝,王 艰,等.3-取代喹喔啉衍生物的合成及其抗肿瘤活性的研究[J].广东药学院学报,2013,29(1):25-28.
[6]汤为学,骆云鹏,王瑞雪.人实体瘤抗癌药物敏感试验 MTT法的建立[J].重庆医科大学学报,1992,17(2):103-108.
[7]李 杰,刘玉琴.MTT法在肿瘤研究中的改良及应用进展
[J].中国肿瘤临床,1998,25(4):312-313.