多发性肌炎并肺间质病变血清蛋白质组学研究

2015-12-19 07:57李秋兰洪文婷林夏鸿陈小青
福建医科大学学报 2015年2期
关键词:肌炎组间蛋白质

李秋兰,章 涛,洪文婷,林夏鸿,林 玲,陈小青

多发性肌炎(polymyositis,PM)是以累及横纹肌为特征的结缔组织病,常合并肺间质病变(interstitial lung disease,ILD),严重影响患者的预后,目前其发病机制尚不明确。笔者科室于2011年11月—2013年11月收治部分PM及PM+ILD患者,通过双向电泳与质谱分析患者血清中表达的差异蛋白,并与正常人群比较,探讨PM的发病机制,现报道如下。

1 对象与方法

1.1 对象 PM患者3例,男性1例,女性2例,年龄分别为45,48,39岁。PM+ILD患者3例,男性1例,女性2例,年龄分别为50,46,44岁。患者均符合Bohan和Peter的PM诊断标准,并行肺部薄层CT检查判断是否伴发ILD。另外收集正常对照组3例,男性1例,女性2例,年龄分别为43,46,48岁。

1.2 方法

1.2.1 试剂 BCA蛋白定量试剂盒(编号:AR0146,中国碧云天公司);IPG 预制胶条(PH3-10,24cm)、3-[(3-胆酞胺醛)-二乙胺1-丙磺]、二硫苏糖醇、丙烯酰胺、十二烷基磺酸钠、尿素、考马斯亮蓝R350、碘乙酰胺等(美国GE公司);甘氨酸、低熔点琼脂糖、N,N’-甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵、四甲基乙二胺、Tris碱、溴酚蓝等(美国Sigma公司);人微量转铁蛋白(MTF)酶联免疫分析试剂盒(美国R & D公司)。

1.2.2 仪器 等电聚焦系统(Ettan IPGphor III)、垂直 电 泳 系 统 (ESP601、Multi Temp Ⅳ)、Image Master 2D分析系统(Platinum 7.0)、扫描仪(美国GE公司);多功能酶标仪(Sunrise,德国Tecan公司)。

1.2.3 测定生化指标 总胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)等采用全自动生化分析仪检测(CX-5型,美国Beckman公司)。

1.2.4 采集与制备标本 每例患者取静脉血6mL,室 温 下 放 置 20min,3 000r/min 离 心15min,取上清,BCA法测定蛋白浓度,计算所需的血清量,保证每个样本含等量蛋白。分别将PM、PM+ILD、对照组3组血清池混制,并分装成3管,-80℃冰箱保存备用。

1.2.5 双向凝胶电泳 将3组血清在相同参数条件下进行平行双向电泳,电泳凝胶用考马斯亮兰染色。染色后的双向电泳凝胶图像用扫描仪扫入电脑,经Image Master系统分析凝胶图像。3组的凝胶图谱进行匹配比对分析。设置平滑(smooth=10)、显著值(saliency=2)、最小区域(min area=5)等参数进行斑点检测,设置landmark蛋白点后进行匹配。数据分析后选取光密度差异(ratio)>2且差别具有统计学意义(P<0.05)的蛋白质点为差异表达的蛋白。

1.2.6 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)) 挖取有明显差异的蛋白点凝胶送昆明赛金公司进行MALDI-TOF-MS分析。利用Mascot搜索引擎,进行MS/MS离子搜索;对获得的肽指纹在SwissProt和NCBI数据库搜索,分析鉴定蛋白。

1.2.7 ELISA方法验证 扩大样本的例数进行验证,共收集PM 或皮肌炎(dermatomyositis,DM))组30例(其中PM患者13例、DM 患者17例)、PM+ILD组6例、DM+ILD组8例、系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)组18例、正常对照组15例,用ELISA方法进行验证。SLE组为疾病对照组,满足无合并肺间质疾病,无发生感染,无合并恶性肿瘤等因素,SLE的诊断符合1997年美国风湿病学会(ACR)修订的SLE分类标准。

1.3 统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件包行统计分析,计量资料以±s表示,组间比较采用独立样本t检验,对于显著偏态分布的资料的组间比较采用Mann-WhitneyU检验。P<0.05为差别具有统计学意义。

2 结 果

2.1 血清蛋白质组的蛋白点差异分析 将PM、PM+ILD、对照组的混合血清在同等条件下重复进行3次双向电泳,获得3组蛋白图谱。其中PM组3张图找到的蛋白质点为(252±11)个,匹配率平均为78.00%;PM+ILD组找到的蛋白质点(235±8)个,匹配率平均为80.305%;对照组找到的蛋白质点为(239±7)个,匹配率平均为79.160%。3组的差异蛋白点进行组间比较:与对照组比较,PM组和PM+ILD组同时表达且表达上调的差异蛋白点有20个、表达下调的4个;与PM组比较,PM+ILD组表达上调的差异蛋白点有2个,表达下调的7个(表1)。对3组的差异蛋白点进行两两比较,有15个明显差异蛋白点(表2)。3组各取一张蛋白质组的双向电泳图谱(图1)。

2.2 质谱鉴定 挖取15个差异明显的蛋白点凝胶送检,经质谱分析鉴定出9种蛋白:(1)与对照组比较,PM组有4个差异蛋白表达上调,1个差异蛋白表达下调,表达上调的差异蛋白成功鉴定为血清淀粉样蛋白A(serum amyloid A protein,SAA)、载脂蛋白 A1(apolipoprotein A-1,apoA-1)、凝 集 素(clusterin,CLU)、血清白蛋白(serum albumin,ALB);表达下调的差异蛋白鉴定为转铁蛋白(serotransferrin,TRF)。PM+ILD组有4个差异蛋白同时表达下调,成功鉴定为 TRF、锌-a2-糖蛋白(zinc-alpha-2-glycoprotein,ZAG)、a2-H2-糖 蛋 白(alpha-2-HS-glycoprotein,AHSG)、a1-β-糖 蛋 白(alpha-1B-glycoprotein,A1BG)。(2)与 PM 组比较,PM+ILD组的2个差异蛋白同时表达下调,鉴定为β2-糖蛋白1(beta-2-glycoprotein 1,β2-GP1)和TRF。成功鉴定出的差异蛋白质质谱结果见表3。

表1 PM组、PM+ILD组及对照组同时表达差异的蛋白质点Tab 1 Differential espressed protein in PM,PM+ILD and HD

表2 PM组、PM+ILD组及对照组比较表达差异的蛋白质点Tab 2 Differential espressed protein among PM,PM+ILD and HD

2.3 生化指标比较 PM与PM+ILD组患者的TC与TG水平均明显高于对照组(P<0.05),且PM+ILD组 TC水平高于PM 组(P<0.05),而TG水平在2组间比较差别无统计学意义(P>0.05,表4)。

图1 PM组、PM+ILD组及对照组的双向电泳图Fig 1 Gels figure of PM,PM+ILD and HD

表3 成功鉴定的蛋白质质谱结果Tab 3 The success of protein mass spectrometry identification results

表4 PM、PM+ILD与对照组的TC、TG比较Tab 4 TC,TG of PM,PM+ILD and HD mmol/L

2.4 TRF在组间的比较 TRF的血清浓度在PM、DM、PM+ILD、SLE、对照组各组间比较,差别均无统计学意义(P>0.05,表5)。

表5 TRF在PM、PM+ILD、SLE和对照组间的比较Tab 5 TRF of PM,DM,PM+ILD,SLE and HD

3 讨 论

现有的研究提示,免疫机制(包括细胞免疫和体液免疫)和非免疫机制均与肌炎患者肌纤维损伤和肌肉功能障碍有关,但是不同机制的具体作用及机制间是否有交叉作用,目前皆不清楚。蛋白质组学可应用于探索复杂疾病的致病机制及寻找疾病诊断分子标记蛋白,目前国外开始尝试将其用于特发性炎症性肌病的研究[1]。本研究应用蛋白质组学对PM组、PM+ILD组与对照组的血清进行分析,成功鉴定出9种蛋白质,以下对它们可能发挥的功能进行讨论:

3.1 可能参与PM发病进程的蛋白 SAA作为载脂蛋白家族中的高度异质类蛋白,是一种非常敏感的急性时相反应物[2-3],也是监测炎症(包括 DM)的指标[4-6]。SAA 的前体即淀粉样原纤维(AA)对PM患者血管的基底膜、细胞、细胞器膜、核膜进行细胞毒性作用[7],促使PM的血管内皮增厚、基底膜改变及血管增殖等,造成皮肤损害与ILD。CLU是一种硫化二聚体糖蛋白,具有组织损伤后重建、脂质转运、细胞粘附、调节细胞凋亡、调节补体活化等功能[8]。PM是一种自身免疫性疾病,可产生多种抗体[9]。CLU作为补体溶解抑制物,与 C5b-9相作用,使免疫复合物丧失活性,阻止抗体依赖补体介导的细胞溶解及炎症反应[10-11],从而限制补体介导炎症反应。另外,细胞内CLU是新一代的惰性细胞毒素的变体,参与慢性内质网应激反应[12],造成肌肉缺氧、损伤。CLU起保护机制因素还是致病性因素,值得进一步研究。

apoA-1是一种负急性时相蛋白,可抑制炎症过程多个环节,起抗炎症保护作用[13]。ALB在一定程度上反应体内炎症反应程度和患者一般消耗状态[14]。低白蛋白症是PM预后不良的独立危险因素,也是PM合并ILD的预测因子[15]。在本次研究中,apoA-1、ALB对PM组患者可能起的是反馈性保护功能。

β2-GP1是一种单链糖蛋白。脂多糖和β2-GP1是对相互作用的蛋白,二者特异性结合后依赖Toll样受体4信号传导通路激活巨噬细胞的NF-κB[16]。持续激活 NF-κB可释放大量炎症因子[17-18],引发细胞损伤和炎症反应。β2-GP1可能参与了PM的炎症与损伤肌细胞的过程。

3.2 可能参与PM+ILD发病进程的蛋白 ZAG是一种分泌性蛋白,参与癌性恶病质的形成[19]。主要通过促进机体脂肪分解和增加产热双重途径来减少体内脂肪。当小鼠患MAC16肿瘤后其ZAG分泌明显增高,表现出明显恶病质,体质量下降,同时脂肪含量显著减少。本研究回顾性分析PM及PM+ILD组患者的生化指标发现,2组患者的TC与TG水平均明显高于对照组,且PM+ILD组TC水平高于PM组。在本研究中,ZAG表达水平PM+ILD组低于PM组。故推测PM合并ILD后使ZAG产生减少,同时也降低合并恶性肿瘤的可能性,与国内外学者关于PM或DM合并恶性肿瘤时再发生ILD的现象相对少见的报道一致[20]。

AHSG是一种负急性时相反应蛋白,可通过抑制炎症细胞激活及炎症因子的释放达到抗炎症的作用[21-22]。AHSG 表 达 水 平 PM+ILD 组 低 于 PM组,提示由于AHSG的降低使得PM+ILD组患者体内炎症细胞激活及炎症因子释放的抑制作用减弱,加速ILD的进程。

A1BG是一种酸性球蛋白,在肺癌、类风湿关节炎等疾病发现过该蛋白,具体功能未知[23-24]。A1BG可能参与了PM+ILD的进展,或是疾病的一种伴发现象。

3.3 可能参与PM及PM+ILD疾病进展的蛋白

氧化应激参与了肺泡上皮细胞损伤和纤维化,氧化应激水平明显升高时,抗氧化物明显降低。当氧化与抗氧化失衡时,肺纤维化发生更为显著[25-26]。TRF是一种体内常见的抗氧化物质。在本次研究中,蛋白组学的TRF表达水平为PM+ILD组<PM组<对照组,提示TRF可能参与PM和PM+ILD疾病的进展。但笔者对PM或DM组、PM或DM+ILD组、SLE组、对照组用ELISA方法进行验证,并进行组间比较,TRF在上述各组间差别均无统计学意义(P>0.05),说明TRF与PM及PM+ILD疾病可能无关,原因可能是样本例数不足,有待扩大样本量再行验证。

目前,2-DE分离蛋白质仍存在一定的局限性[27],主要是对低丰度蛋白质、疏水性蛋白、极度酸性或碱性蛋白、极高或极低相对分子质量等蛋白不能进行有效分离,尤其是外周血清蛋白质数量多,来源广,蛋白质差别大,都在一定程度上限制蛋白质组学的研究。

综上所述,TRF与PM及PM+ILD疾病的进展可能无关,而另8种蛋白SAA、CLU、ALB、apoA-1、ZAG、AHSG、A1BG、β2-GP1等为进一步深入研究PM及PM+ILD的致病机制提供了方向,但它们如何参与疾病的进程和具体的作用,以及是否所有的PM+ILD、PM病例都存在相同的差异表达蛋白,仍然需要大样本的验证实验来进一步明确。

[1]Passadore I,Iadarola P,DiPoto C,etal.2-DE and LC-MS/MS for a comparative proteomic analysis of BALf from subjects with different subsets of inflammatory myopathies[J].ProteomeRes,2009,8(5):2331-2340.

[2]Betts J C,Edbrooke M R,Thakker R V,etal.The human acute-phase serum amyloid:agene family:structure,evolution and expression in hepatoma cells[J].ScandJImmunol,1991,34:471-482.

[3]Urieli-Shoval S,Linke R P,Matzner Y.Expression and function of serumamy loid A,amajor acutephase protein,innormal and disease states[J].CurropinHematol,2000,7(1):64-69.

[4]Susan H,Changjie S,Geczy Carolynl L,etal.A role for acutephase serum amyloid A and high-density lipoprotein in oxidative stress,endothelial dysfunotion and atherosclerosis[J].RedoxReport,2009,14(5):187-196.

[5]Kisilevsky R.Serum amyloid A(SAA),aprotein without a function:some suggestions with reference to cholesterolmetabolism[J].MedHypotheses,1991,35:337-341.

[6]杨 闵,梁 燕,蔡娅菲,等.皮肌炎患者外周血急性时相反应物水平与IL-6、疾病活动度相关性分析[J].四川大学学报:医学版,2000,44(5):814-817.

[7]Garcia-Garcia M,Mourad G,Durfort M,etal.Vascular involvement and cell damage in experimental AA and clinical beta(2)-microglobulin amyloidosis[J].NephrolDialTransplant,2002,17(8):1450-1456.

[8]Iams J D,Casal D,Mc Gregor J A,etal.Fetal fibronectin improves the accuracy of diagnosis of preterm labor[J].AmJ ObstetGynecol,1995,173(1):141-145.

[9]张乃峥.炎性肌病(多发性肌炎、皮肌炎)[M].上海:上海科学技术出版社,1999:264-273.

[10]Cong L,Pu C Q,Shi Q,etal.Complement membrane attack complex is related with immune-mediated necrotizing myopathy[J].IntJClinExpPathol,2004,7(7):4143-4149.

[11]Rosenberg M E,Girton R,Finkel D,etal.Apolipoprotein J/clusterin prevents a progressive glonerulopathy of aging[J].MolCellBiol,2002,22(6):1893-1902.

[12]Kang S W,Yoon S Y,Park J Y,etal.Unglycosylated clusterin variant accumulates in the endoplasmic reticulum and induces cytotoxicity[J].IntJBiochemCellBiol,2013,45(2):221-231.

[13]林 化,马春林,王荣辉,等.血清前清蛋白、C反应蛋白及载脂蛋白A1对重症肺炎患者预后评估的价值[J].重庆医学,2014,43(5):529-531.

[14]盛 君,陆进明,宣 丹,等.92例多发性肌炎/皮肌炎患者短期生存预后相关因素分析[J].中国临床药理学与治疗学,2014,19(6):674-679.

[15]Ji S Y,Zeng F Q,Guo Q,etal.Predictive factors and unfavourable prognostic factor of interstitial lung disease in patients with polymyositis or dermatomyosites:a retrospective study[J].ChinMedJ(Engl),2010,123(5):517-522.

[16]Laplante P,Amireault P,Subang R,etal.Interaction of β-2-GlycoproteinⅠwith lipopolysaccharide leads to Toll-like receptor 4(TLR4)-dependent activation of macrophages[J].BiolChem,2011,286:42494-42503.

[17]Ikebe M,Kitaura Y,Nakamura M,etal.Lipopolysaccharide(LPS)increase the invasive ability of pancreatic cancer cells through the TLR4/MyD88signaling pathway[J].Surg Oncol,2009,100:725-731.

[18]Szajnik M,Szczepanski M J,Czystowska M,etal.TLR4 signaling induced by lipopoiysaccharide or paclitaxel regulates tumor survival and chemoresistance in ovarian cancer[J].Oncogene,2009,28:4353-4363.

[19]Bing C,Trayhum P.Regulation of adipose tissue metabolism in cancer cachexia[J].CurrOpinClinNutrMetabCare,2008,11(3):201-207.

[20]苟丽娟,苏金梅,赵 岩,等.皮肌炎和多发性肌炎伴发肿瘤临床特点及文献回顾[J].中华临床免疫和变态反应杂志,2012,6(4):295-299.

[21]Gangneux C,Daveau M,Hiron M,etal.The inflammation in duced down regulation of plasma Fetuin-A(2HS-Glycoprotein)in liver results from the loss of interaction between long C/EBP isoforms at two neighbouring sites[J].NucleicAcids Res,2003,31(20):5957-5970.

[22]Ren J,Davidoff A J.Alpha2-Heremans-Schmidt glycoprotein,aputative inhibitor of tyrosine kinase,prevents glucose toxicity associated with cardiomyocyte dysfunction[J].DiabetesMetabRev,2002,18(4):305-310.

[23]Lu Y S,Luo X Y,Hu H C,etal.Integrative proteomics and tissue microarray profiling indicate the association between overexpressed serum proteins and non-small cell lung cancer[J].PLoSOne.2012,7(12):e51748.

[24]Sagarika B,Saurabh S,Ashish S,etal.Identification of novel autoantigen in the synovial fluid of rheumatoid arthritis patients using an immunoproteomics approach[J].PLoS One,2013,8(2):e56246.

[25]Walters D M,Cho H Y,K leeberger S R.Oxidative stress and antioxidants in the pathogenesis of pulmonary fibrosis apotential role for nrf2[J].AntioxidRedoxSign,2008,10(2):321-332.

[26]Liu R,Ahmed K M,Nantajit D,etal.Therapeutic effects of alpha-lipoic acid on bleomycin-induced pulmonary fibrosis in rats[J].IntJMolMed,2007,19(6):865-873.

[27]Fujii,Nakano T,Kawamura T,etal.Mulitidimensional protein profiling technology and its application to human plasma proteome[J].JProteomeRes,2004,3(4):712-718.

猜你喜欢
肌炎组间蛋白质
蛋白质自由
miR-340、Th17/Treg在皮肌炎/多发性肌炎发病机制中的作用研究
浅析孟毅分期论治多发性肌炎与皮肌炎经验
人工智能与蛋白质结构
数据组间平均数、方差关系的探究
更 正
Geological characteristics, metallogenic regularities and the exploration of graphite deposits in China
儿童急性良性肌炎26例临床分析
实验室检测对多发性肌炎及皮肤炎患者预后评估的意义
Numerical Solution of Fractional Fredholm-Volterra Integro-Differential Equations by Means of Generalized Hat Functions Method