电针通过eNOS 促进局灶脑缺血/再灌注大鼠脑缺血皮质区血管再生

胥虹贝 罗 勇 朱艳含 李 娟 王盼欣 张 莹

(重庆医科大学附属第一医院神经内科，重庆市神经病学重点实验室，重庆 400016)

缺血性脑血管病为临床常见病、多发病，具有高死亡率、高致残率的特点，严重危害人类健康与生命。脑缺血损伤后，内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)可在多种细胞因子介导下从骨髓动员至外周血，并归巢至脑缺血区参与血管再生及修复，促进神经功能恢复［1-3］。针刺作为中国传统的“非药物”治疗手段，对脑缺血后神经、血管再生具有显著的临床效应［4］。内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)/基质金属蛋白酶-9(Matrix Metallopeptidase 9，MMP-9)是磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol-3 kinase)/蛋白激酶B(protein kinase B)(PI3K/AKT)信号转导通路介导下促进骨髓EPCs动员的关键因素［3，5-6］。本团队前期研究发现［7］，电针可上调大脑缺血皮质区 eNOS及MMP-9表达，但此作用是否与电针促进血管再生直接相关并不明确。故本研究通过观察电针及eNOS特异性拮抗剂L-NAME干预下大脑缺血皮质区eNOS、MMP-9表达变化和CD34+微血管再生情况，以期进一步探讨电针促进局灶脑缺血/再灌注后脑内血管再生的机制。

材料和方法

1.实验动物与分组

SPF级成年雄性 SD大鼠120只，体重250～300g，由重庆医科大学动物中心［SCXK(渝)2012－0002］提供。大鼠随机分为正常组(NC组)、模型组(I/R组)、电针组(I/RE组)和电针 +L-NAME组(I/REL组)。根据局灶脑缺血90min再灌注后观察的时间点，将I/R、I/RE和I/REL组各分为再灌注1d、3d和7d三个时相点，每个亚组12只。

2.主要试剂盒仪器

eNOS多克隆抗体(Abcam公司，英国)、MMP-9多克隆抗体(Abcam公司，英国)、CD34多克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology公司，美国)，L-NAME(上海碧云天生物有限公司，中国)、免疫组化试剂盒及DAB显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司，中国)、荧光定量PCR相关试剂(Takara公司，日本)，eNOS引物(上海生物生工有限公司合成)，G6850型电针治疗仪(购自北京精工仪器厂)。

3.动物模型建立与筛选

采用改良线栓法并参照罗勇等［8］介绍的经验规范化制备SD大鼠右侧大脑中动脉缺血/再灌注模型(middle cerebral artery occlusion/reperfusion，MCAO/R)。大鼠术前禁食一晚，不禁饮。3.5%水合氯醛(1ml/100g)腹腔注射麻醉大鼠，颈部脱毛后仰卧位固定于手术台，常规消毒后在无菌条件行颈正中纵行切口，充分暴露右侧颈总动脉(CCA)，分离颈外动脉(ECA)、颈内动脉(ICA)颅外段，分离 ECA、ICA交通支后结扎ECA远端，沿ICA向下分离翼颚动脉，穿线沿起点结扎，在ECA残端剪一小口，缓慢插入预先准备的头端圆钝、直径约0.25－0.27mm的线栓，线栓经CCA分叉处进入ICA，线栓头端距离分叉处约18－20mm处感插线栓有明显阻力，表示线栓头端已到达大脑中动脉起始端，停止继续推进栓子，固定线栓，清理手术野，缝合皮肤。栓塞90min后拔出线栓至ECA残端实现再灌注。待大鼠完全清醒后，采用Longa 5分法［9］进行神经功能评分:0分:无神经功能缺失症状;1分:轻度局灶神经功能缺失(不能完全伸展左侧前肢);2分:中度局灶神经功能缺失(向左侧转圈);3分:重度神经功能缺失(向左侧倾倒);4分:不能自发行走，意识水平降低。评分为2－3分者视为造模成功，入选实验。排除标准:1、神经学症状评分低于2分或等于4分者;2、取脑时发现蛛网膜下腔出血者;3、脑组织石蜡切片HE染色无缺血病理改变者;4、未到观察时相点死亡者。凡因各种原因导致各实验组动物数不足预定数量者，均按照随机抽样原则补齐实验动物。

4.电针刺激及L-NAME干预方法

参照中国针灸学会实验针灸委员会制定的实验动物穴位图谱，选取大鼠“百会”穴(GV 20)及左侧“四关”穴(合谷LI 4/太冲 LR 3)为电针穴位，利用华佗牌不锈钢银针(直径为0.38mm，长度为1寸)取“百会”穴斜刺入头皮1mm，直刺“合谷”穴及“太冲”穴2mm，针刺“百会”穴及“四关”穴通电刺激。连接电针治疗仪，刺激参数采用频率为2/20 Hz，波型为疏密波，强度以大鼠肢体轻微震颤为度。I/RE与I/REL组首次电针刺激于再灌注后1h进行，刺激时间20min/次，每日治疗1次，最长7d。I/REL组大鼠在缺血90min后电针刺激前1h开始腹腔注射L-NAME，每次8mg/kg，每日 1 次，最长 7d，L-NAME终浓度为8mg/mL(每8mg的L-NAME溶于1mL的生理盐水)［10］。

5.Q-PCR 检测

按Takara说明书提取各组大鼠大脑缺血区皮质总RNA，取1μl总RNA逆转录为20μl cDNA。根据GenBank提供的基因序列，扩增大鼠eNOSmRNA的上游引物为5'-GCAGAGGAGTCCAGCGAACA-3'，下游引物为 5'-GAAATTGTTCCAGCACCTCTAGC-3'，产物长度115bp。扩增条件为预变性95℃ 30s，PCR 反应95℃ 5s、60℃ 30s，40 个循环。

6.免疫组织化学染色

将切片脱蜡至水，微波修复26min(高火3min，低火3min，低火与解冻之间20min)，自然冷却至室温，3%H2O2室温孵育30min，加动物血清37℃封闭30min，加一抗(eNOS、MMP-9和CD34一抗稀释比例分别为1∶100、1∶100 和1∶50)，同时滴加PBS 代替一抗作阴性对照，4℃过夜;第2d 37℃孵育1.5h，加二抗37℃孵育30min，加链霉素标记卵蛋白，室温孵育20min，DAB显色，苏木素染核、脱色、返蓝、酒精脱水、透明、封片。

7.结果判定

所有切片均标号，取非连续的3张切片，每张切片读取非连续的5个视野取值。eNOS及MMP-9蛋白半定量分析:在400倍视野下，采用Image-Pro Plus 16.0图像测量分析软件自动测定观察区胞浆染为黄色或棕黄色的阳性细胞平均光密度值(Mean Optical Density，MOD)，即为eNOS及MMP-9蛋白表达结果。缺血区微血管密度(Microvessel Density，MVD)结果判定:根据Weidner等［11］改良血管计数法，在200倍视野下观察，CD34表达以血管内皮细胞内有浅棕色至深棕色颗粒沉着为标准，计数CD34+微血管密度(血管直径＜20μm或单个细胞阳性但和周围细胞分界清楚视为一个新生血管)，微血管数(个/HP)为每个视野下的血管数。

8.统计学分析

结 果

1.电针及L-NAME干预对局灶脑缺血/再灌注大鼠大脑缺血皮质区eNOS蛋白免疫反应性的影响

免疫组化结果显示，NC组大鼠右侧大脑皮质eNOS表达很少。I/R和I/RE组再灌注后各时间点eNOS表达均显著高于NC组(P＜0.01)，I/RE组各时间点的表达较I/R组增多(P＜0.05)。在eNOS特异性拮抗剂L-NAME作用下，I/REL组再灌注后各时间点eNOS表达均低于I/RE组(P＜0.05)(图1)

2.电针及L-NAME干预对局灶脑缺血/再灌注大鼠大脑缺血皮质区eNOSm RNA表达的影响

Q-PCR结果显示，eNOS mRNA表达规律与eNOS蛋白表达一致。I/RE组各时间点的表达均明显高于I/R组(P＜0.05)。eNOS作用被阻断后，I/REL组eNOS mRNA表达显著低于I/RE组(P＞0.05)。

3.电针及L-NAME干预对局灶脑缺血/再灌注大鼠大脑缺血皮质区MMP-9蛋白免疫反应性的影响

免疫组化结果显示，NC组大脑皮质MMP-9表达很少。I/R组MMP-9表达于再灌注后1d开始增加(P＜0.05)，3d时达到高峰(P＜0.05)，7d时开始下降(P＜0.05)。再灌注后1d、3d，I/RE组MMP-9表达较I/R组明显降低(P＜0.05)，7d时I/RE组显著多于I/R组(P＜0.05)。在L-NAME作用下，I/REL组再灌注后1、3d，MMP-9表达较I/RE组增多(P＜0.05)，7d时明显低于I/RE组(P＜0.05)。与I/R比较，I/REL组表达差异无统计学意义(P＞0.05)(图3)。

4.电针及 L-NAME干预对局灶脑缺血/再灌注大鼠大脑缺血皮质区CD34+微血管密度(MVD)的影响

免疫组化结果显示，1d新生血管以单个细胞为主，管径较小;7d新生血管密度增多，不同管径血管并存。与I/R组比较，I/RE组各时间点CD34+微血管密度均显著增多(P＜0.05)，在L-NAME作用下，I/REL组各时间点微血管数目均明显低于I/RE组(P＜0.05)(图4)。

图1 免疫组化显示各组不同时间点eNOS蛋白表达变化(400×)A1，A3，A7:I/R 1d，I/R 3d，I/R 7d;B1，B3，B7:I/RE 1d，I/RE 3d，I/RE 7d;C1，C3，C7:I/REL 1d，I/REL 3d，I/REL 7d;D:NC;*:P ＜0.01 与 NC 组比较;#:P ＜0.05 与I/R和I/REL组比较Fig.1 Changes of the expression of eNOS in each group detected by immunohistochemistry at different time points(400 × )A1，A3，A7:I/R 1d，I/R 3d，I/R 7d;B1，B3，B7:I/RE 1d，I/RE 3d，I/RE 7d;C1，C3，C7:I/REL 1d，I/REL 3d，I/REL 7d;D:NC;*:P ＜0.01，compared with NC group;#:P ＜0.05;comapred with I/R and I/REL groups

图2 Q-PCR显示各组不同时间点MMP-9蛋白表达变化 *:P＜0.01与NC组比较;#:P＜0.05与I/R和I/REL组比较Fig.2 Changes of the expression of eNOS in each group detected by Q-PCR at different time points *:P ＜0.01，compared with NC group;#:P＜0.05;compared with I/R and I/REL groups

图3 免疫组化显示各组不同时间点MMP-9表达变化(400×)A-D:NC，I/R 7d，I/RE 7d，I/REL 7d;*:P＜0.05与NC组比较;#:P＜0.05与I/R和I/REL组比较Fig.3 Changes of the expression of MMP-9 in each group detected by immunohistochemistry at different time points(400 × )AD:NC，I/R 7d，I/RE 7d，I/REL 7d;*:P ＜0.05，compared with NC group;#:P ＜0.05;comapred with I/R and I/REL groups

图4 免疫组化显示各组不同时间点CD34+微血管密度变化 A:NC;B:I/R 7d;C:I/RE 7d;D:I/REL 7d(200×);A1:NC;B1:I/R 7d;C1:I/RE 7d;D1:I/REL 7d(400×);*:P＜0.05，与NC组比较;#:P＜0.05，与I/RE和I/REL组比较Fig.4 Changes of number ofCD34+microvessels in each group detected by immunohistochemistry at different time points.A:NCgroup;B:I/R group 7d;C:I/RE group 7d;D:I/REL group 7d(×200);A1:NC;B1:I/R 7d;C1:I/RE 7d;D1:I/REL 7d(400×);*:P＜0.05，compared with NC group;#:P ＜0.05，compared with I/RE and I/REL groups

讨 论

穴位针刺用于治疗缺血性脑血管病已有数千年历史，并已得到广泛应用和认可。研究表明，“百会”穴与“四关”穴的配伍能够达到醒脑开窍、舒经活络、祛痰化瘀的作用，是治疗脑卒中最常选取的基础穴。EPCs作为一群具有游走性，能进一步增殖并定向分化的幼稚内皮细胞［12］，主要存在于机体骨髓［13］。脑缺血发生后，损伤组织释放HIF-1(缺氧诱导因子)可诱导 VEGF、SDF-1、Ang-1、Tie-2等细胞因子表达上调，促进骨髓EPCs动员至外周血，进而分化为成熟内皮细胞进行循环、增殖，参与脑缺血区血管再生。Iskander等［14］通过 MRI证实，经静脉给予MCAO模型大鼠脐带血来源的EPCs可定向迁移至脑梗死灶周围，减少梗死面积，促进神经及血管再生。移植人体晚期的EPCs可增加卒中后大脑皮质局部血流量，减少细胞凋亡，减轻神经功能缺损［15］。EPCs在增殖分化过程中，细胞表面标记呈现动态组合的变化，研究发现，电针可上调局灶脑缺血/再灌注大鼠骨髓及外周血VEGFR2+EPCs、VEGFR2+PECAM-1+EPCs、VEGFR2+CD31+EPCs 数量，促进骨髓EPCs动员至外周血［16-18］。关于电针通过何种途径促进骨髓EPCs动员至外周血，参与脑缺血后脑内血管再生，是目前的研究热点和难点。

研究表明，eNOS/MMP-9在促进骨髓EPCs动员及缺血后脑内血管再生方面发挥重要作用。脑缺血发生后，脑内PI3K/AKT信号途径被激活，活化的AKT可诱导eNOS磷酸化，增加一氧化氮(NO)合成，NO促进MMP-9硝基化，活化的MMP-9促使膜结合性Kit配体(mKitL)转化为可溶性配体(sKitL)，使EPCs易于脱离骨髓微环境参与缺血区血管生成［19-20］。Aicher 等［21］研 究 发 现 缺 乏 eNOS 的Nos3(－/－)小鼠骨髓中 MMP-9明显减少，由 mKitL转化而来的sKitL相应减少，从而使依赖eNOS/MMP-9的干/祖细胞动员明显减弱;而在重新注入sKitL后，动员作用恢复，eNOS激活为MMP-9活化，并促使基底膜降解，促进骨髓微环境中EPCs动员至外周血。Cui等［22］发现eNOS可以促进脑梗死后的血管再生，敲除eNOS基因的小鼠较野生型小鼠脑梗死后死亡率高，神经功能缺损症状更为明显，在使用NO供体DETA-NONOate后明显改善。提示eNOS/MMP-9在促进EPCs动员及脑内血管再生中具有重要作用。归巢至缺血区的EPCs可参与缺血组织的血管重建和损伤血管的再内皮化过程，由于成熟血管内皮表达的CD34主要存在于毛细血管网，大血管内皮不表达CD34［23］，因此采用CD34作为标记计数新生血管密度，具有较强的特异性、敏感性和可重复性［24］，故本研究采用CD34标记新生微血管。由于目前关于eNOS/MMP-9在电针促进脑缺血后血管再生中的作用探讨未见采用eNOS特异性拮抗剂L-NAME阻断eNOS作用，并进一步研究脑内微血管再生情况。本研究旨在采用药物干预，直接证实电针通过eNOS/MMP-9对血管再生的作用。既往研究表明［10］，采用腹腔注射L-NAME，计量为8mg/kg能达到最好的阻断eNOS效果，故本研究采用上述干预手段阻断eNOS作用。本研究结果表明，电针组eNOSmRNA及蛋白表达随再灌注时间的延长呈进行性递增趋势，再灌注后1d、3d，电针组MMP-9表达显著降低，CD34+微血管密度明显升高，神经功能缺损症状得到明显改善，而腹腔注射L-NAME后，电针对脑缺血的保护作用明显受到抑制，表明在缺血早期，电针可通过上调eNOS表达、抑制内源性MMP-9合成和分泌，促进缺血区血管再生。既往研究表明，脑梗塞24h时在缺血区及其周边的内皮细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞中检测到MMP-9，MMP-9可通过蛋白水解作用破坏毛细血管壁紧密连接和基底膜，继而引起血管源性水肿［25-26］。结合本实验研究结果，推测电针在缺血早期抑制MMP-9的表达促进微血管再生与电针抑制MMP-9在缺血早期介导的二次损伤有关。而再灌注后7d，电针组MMP-9表达较模型组显著升高，CD34+微血管密度持续增多，神经功能进一步改善，在L-NAME特异性阻断eNOS作用后，电针促MMP-9表达的作用明显受到抑制，与此同时，新生微血管数目减少更为显著。结合本团队前期研究［27］，我们推测:电针可促进缺血后骨髓 CD34+EPCs持续动员至外周血，在缺血后期电针可持续上调eNOS表达并介导MMP-9表达升高，而激活的MMP-9可能主要发挥清除基质细胞上粘附的结合作用［20］，使得EPCs通过跨内皮迁移离开骨髓参与血管再生，但其内在机制错综复杂，有待我们进一步的深入研究。

本研究在既往研究的基础上，采用腹腔注射LNAME特异性阻断eNOS作用，同时研究不同组别及对应时间点脑内血管再生情况。发现电针上调缺血皮质区 eNOS，早期下调 MMP-9表达、晚期上调MMP-9表达以及促进缺血区血管再生的作用被减弱，直接证实了电针可通过eNOS/MMP-9发挥脑缺血后脑内保护作用，并进一步证明了电针可能通过eNOS/MMP-9介导骨髓EPCs动员归巢至缺血区参与血管再生，为电针在临床上治疗脑梗死中提供坚实的理论依据。

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