小麦麸皮抗冻蛋白提取的关键因素及其优化

金周筠 刘宝林

（上海理工大学医疗器械与食品学院生物系统热科学研究所，上海 200093）

小麦麸皮抗冻蛋白提取的关键因素及其优化

金周筠 刘宝林

（上海理工大学医疗器械与食品学院生物系统热科学研究所，上海 200093）

研究小麦麸皮抗冻蛋白提取率偏低与热滞活性（Thermal Hytersis Activity，THA）易破坏的问题。在单因素试验的基础上，采用中心组合试验设计与响应面分析方法对液料比、缓冲液pH、缓冲液浓度、饱和硫酸铵浓度这4个因素进行优化，建立响应值（包括：蛋白提取率、THA）与各影响因素之间的回归方程，得出最优提取条件为液料比7.5∶1、缓冲液pH 7.8、缓冲液浓度29 mmol／L、饱和硫酸铵浓度100%，在此条件下蛋白提取率理论值为41.46%、THA 0.019 5℃；验证试验表明蛋白提取率为41.98%，THA为0.019℃，证明优化结果是可靠的。

小麦麸皮抗冻蛋白 提取 响应面分析 优化

抗冻蛋白（Antifreeze Protein，AFP）是一种能够抑制冰晶生长和重结晶的蛋白，能非依数性地降低溶液的冰点而对其熔点影响很小，这种冰点与熔点之间的差异称为热滞活性（Thermal Hysteresis Activity，THA），因此，抗冻蛋白又被称为热滞蛋白。抗冻蛋白在鱼类、昆虫、植物、微生物等中均有分布，各来源的抗冻蛋白已成功运用于食品、生物、农业等方面，具有广阔的应用前景［1－2］。

2.2 两组体格参数及实验室指标比较 结果(表1)表明：随访前，与非进展组相比，进展组BMI、腰围、WHtR、WHR较大，ALT、AST、UA、TG较高，BUN、Scr、HDL-C较低，差异均有统计学意义(P<0.05)。进展组随访时间[(3.62±1.79)年]长于非进展组[(3.11±1.81)年，P<0.05]。随访结束时，两组间上述指标差异与随访前一致(P<0.05)；随访结束时，进展组FBG、HB、FT3高于非进展组(P<0.05)。

1992年，Griffith等［3］提出获得植物内源抗冻蛋白，从经低温锻炼的能够忍受细胞外结冰的冬黑麦叶片质外体中纯化了该蛋白。目前，多种植物抗冻蛋白已被分离纯化和表征，包括冬黑麦（SecalecerealeL.）、胡萝卜（Daucus carota）、冬小麦（Triticum aestivum）、沙冬青（Ammopiptanthus mongolicus）等［4］。我国作为小麦生产大国，每年仅小麦加工副产物——小麦麸皮的产量即达2 000万t以上，成本低廉，且安全性高；若从中提取出高活性的抗冻蛋白，将是丰富的可利用资源［5］。

根据以上课程，哲学要讲授心理学、道义学(伦理学)、论理学、纯正哲学，不包含“印度及中国哲学”(东洋哲学)。由后续情况看，哲学科因1881(明治14)年的改正而独立后，开始讲授新设科目“印度及中国哲学”(东洋哲学)。

目前，抗冻蛋白提取最主要的问题是蛋白提取率偏低与热滞活性易破坏的问题，如夏露等［6］在pH 8.0，提取时间3 h，液料比5∶1，条件下获得的冬麦粗提抗冻蛋白提取率为30%，THA为0.016℃。金涛等［7］用真空渗透离心法提取燕麦抗冻蛋白，在50 mmol／L PBS，0.35 MPa真空度下，真空 1 h得率仅为0.085 mg／g。在预试验阶段，参考前人提取条件［8］，在液料比 5∶1、缓冲液 pH 8.0、缓冲液浓度 20 mmol／L、提取时间4 h、饱和硫酸铵浓度100%时，提取率仅为31.23%，THA为0.017 5℃。一般认为，其影响因素主要包括液料、缓冲液浓度、提取时间及饱和硫酸铵浓度等，这些因素对以上2个指标的影响或协同或拮抗。在参考米糠蛋白、燕麦蛋白的提取工艺的基础上［9－11］，本试验采用响应面法优化抗冻蛋白的提取工艺参数，保证其热滞活性不受损伤，为小麦副产物综合利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

小麦麸皮由上海市崇明县堡镇小漾村提供。

标准蛋白分子质量Marker：碧云天生物技术研究所。

无机锚固胶：采用NK尼高无机锚固胶，相关安全性能指标和工艺性能标准应符合GB 50728—2011《工程结构加固材料安全性鉴定技术规范》第4.2节和第4.8节中Ⅰ类A级胶的规定，相关技术要求应符合JGJ/T 271—2012《混凝土结构工程无机材料后锚固技术规程》的相关规定。

2.1.3 缓冲液pH对蛋白质提取率及THA的影响

1.2 仪器与设备

根据单因素试验结果，使用Design Expert软件对液料比、缓冲液pH值、缓冲液浓度、饱和硫酸铵浓度4个因素分别在3个水平上进行中心组合试验设计，考察的指标为蛋白提取率与THA。共有29个试验点，其中包括16个析因点，5个中心点和8轴向点。轴向点代表了每个独立变量的极值水平；中心点代表中心水平，重复7次以估计试验误差。响应面分析因素与水平见表1，结果见表2。

1.3 方法

1.3.1 小麦麸皮的预处理

当然，腊味饭中最有年味的做法，当属腊味八宝饭。八宝饭多是甜味糯米饭，所谓八宝指的是杏仁、梅子、葡萄干之类的甜食。然而，咸味的腊味八宝饭，更能勾人食欲。八宝并不一定是八种食材，只是取其丰盛吉祥之意。腊味八宝饭主要采用干货杂粮，寓意是五谷丰登，团圆富贵。

1.3.2 蛋白质提取率的计算

采用考马斯亮蓝比色法测定蛋白提取液中蛋白含量。

1.3.3 蛋白质提取工艺的研究

将20 g小麦麸皮置于烧杯中，加入一定比例、一定浓度的缓冲液，不停搅拌，在预设定提取时间结束后，离心分离，收集上清液，将上清液用不同浓度的饱和硫酸铵进行沉淀，沉淀在蒸馏水中复溶，用截流相对分子质量6 ku的透析膜对纯水透析12 h，浓缩、冻干，获得粗提物，并采用DSC法检测其THA。

1.3.4 DSC法测定样品的热滞活性

参照陈廷超等［12］的方法稍作改动。将10μg样品密封于铝制坩埚中，放置在样品池中央，降温至－30℃，然后升温至25℃，再降温至－30℃。接着，缓慢升温至样品体系为固液混合物状态，称为保留温度（Th），停留2 min，再将温度从Th降低至－30℃，重复上述过程，在不同的Th下停留2 min。记录不同Th下，样品结晶的起始温度（T0），上述过程中升降温的速率均为1.0℃／min。THA参照如下公式：

1.3.5 蛋白质分子质量的测定

电泳参照LaemmLi的不连续系统，并稍作改进，使用4%和15%（质量分数）的浓缩胶和分离胶。

古董市场里不光商品琳琅满目，而且各家店铺的老板更是些狠角色，王祥还没来得及开口问自己的东西怎么卖，就差点被人忽悠着买下一个“光绪帝用过的犀角杯”，幸好他没这个闲钱。打这之后，王祥就不敢再找这些老板们做生意了，不过这趟也没白来，王祥最终在古玩市场外找到了自己的“归宿”——摆地摊。

1.3.6 蛋白的分离纯化

粗提抗冻蛋白按照阳离子交换色谱、凝胶过滤色谱和高效液相色谱这3个步骤纯化，对活性组分透析后冻干。

在采用20 mmol／L缓冲液、液料比6∶1、提取时间4 h、80%饱和硫酸铵条件下，研究缓冲液不同pH对蛋白质提取率及THA的影响。由图3可知，随着缓冲液pH的升高，提取率逐渐增大。受缓冲液性质的影响，其pH不宜高于8.0；且高pH易使目标蛋白发生变性，因此未考虑进一步提高pH已获得更高的蛋白提取率。同时，由图3可知，随着pH的升高，THA也逐渐增大。因此，可以推断，缓冲液pH对蛋白提取率及THA有较大影响。

分别试验研究液料比、提取时间、缓冲液pH值、缓冲液浓度以及饱和硫酸铵浓度对小麦麸皮抗冻蛋白提取率的影响。在单因素试验的基础上，确定中心组合试验设计的自变量及水平，以蛋白提取率与THA两个指标为响应值，通过响应面分析（RSA）方法进行数据的回归分析及显著性检验，以确定提取最优工艺条件。每个试验点重复2次，结果取平均值。数据处理过程中各自变量的水平转换为无因次代码表示：

式中：xi为自变量的代码值；Xi为自变量的真实值；X0为自变量中心水平处真实值；ΔXi为步长。数据处理采用Design Expert软件，将试验数据进行二次方程回归拟合得到各次项系数。在RSA给出的最优条件下通过试验证明预测的可靠性。

对以上两模型分别进行方差分析，结果如表3所示。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验

2.1.1 液料比对蛋白质提取率及THA的影响

在采用20 mmol／L PBS缓冲液（pH 7.4）、提取时间4 h、80%饱和硫酸铵条件下，研究不同液料比对蛋白质提取率及THA的影响。由图1可知，在液料比4∶1时，蛋白质的提取率比较低，仅为23%左右，随着液料比的上升，蛋白质的提取率不断上升，在液料比6∶1～8∶1之间时，提取率趋于最大，进一步增加液料比对提取率影响不大。出于节能的考虑，将中心点定在液料比7∶1左右。同时，由图1可知，液料比对THA无明显影响。

图1 液料比对小麦麸皮提取率及THA的影响

2.1.2 提取时间对蛋白质提取率及THA的影响

在采用20 mmol／L PBS缓冲液（pH 7.4）、液料比6∶1、80%饱和硫酸铵条件下，研究不同提取时间对蛋白质提取率及THA的影响。由图2可知，提取时间对提取率无明显影响，提取4 h与提取2 h相比，提取率仅提高了2个百分点左右，因此基本可认为提取时间对蛋白质的提取率不是关键因素。同时，由图2可知，提取时间对THA无明显影响。

图2 提取时间对小麦麸皮提取率及THA的影响

GNSS RTK在低收入农村科技帮扶工作中的应用…………………………………… 刘爱军，焦有权，黄海力（4-275）

将小麦麸皮粉碎过100目筛，常温下储藏备用。根据GB 5009.5—2010的标准测定，其蛋白质质量分数为14.22%。

1.3.7 试验设计

对随机抽取的77名同学从专业理论知识、岗位技能水平、学习目标的明确性、学习积极性等四个方面的个人水平提高进行了调查，普遍认为有帮助(约58%—66%)或者有很大帮助(约22%—28%)，也有少部分同学(约3.8%—8.7%)认为存在问题，以学习积极性的提高存在困难为首。可见，课程建设在帮助学生提高个人水平方面满意度情况较好

第七步：岗位练兵。按战斗班组将队员分为两组，依次严格按照标准作业流程开展岗位练兵，安全员要全程做好时间记录和过程监督，如发现练兵过程中存在未按岗位标准作业流程执行，则对照考核细则进行加时惩罚；如发现不安全行为，应立即进行纠正。其他练兵人员要认真观察练兵过程。

图3 缓冲液pH对小麦麸皮提取率及THA的影响

2.1.4 缓冲液浓度对蛋白质提取率及THA的影响

在液料比6∶1、提取时间4 h、80%饱和硫酸铵条件下，研究缓冲液浓度（pH 7.4）对蛋白质提取率及THA的影响。由图4可知，提取率随着缓冲液浓度的增加呈上升趋势，缓冲液浓度为20 mmol／L以上时，较10 mmol／L是的提取率上升了近10%，说明缓冲液浓度对是提高提取率的关键因素之一。造成这一较大影响的因素可能是：当缓冲液达到某一浓度时，其离子强度增加，对目标蛋白的作用加强，有助于其溶出。随着PBS缓冲液浓度的进一步提高，蛋白提取率无明显变化，因此将中心点取在30 mmol／L较为合适。同时，由图4可知，缓冲液浓度对THA无明显影响。

图4 缓冲液浓度对小麦麸皮提取率及THA的影响

2.1.5 饱和硫酸铵浓度对蛋白质提取率及THA的影响

采用饱和硫酸铵溶液对蛋白上清液进行沉淀，能有效富集蛋白质。由图5可知，蛋白质提取率与饱和硫酸铵浓度基本正相关，饱和硫酸铵溶液的浓度越高，提取率越高，富集效果越好。因此，可采用100%对上清液进行沉淀。由图5可知，随着饱和硫酸铵浓度的升高，THA有逐渐变大的趋势，当饱和硫酸铵浓度达80%时，THA增大趋势变缓。

图5 饱和硫酸铵浓度对小麦麸皮提取率及THA的影响

2.2 中心组合试验设计结合响应面分析法优化提取工艺参数

2.2.1 模型的建立

Pyris Diamond差示扫描量热仪：美国Perkin－Elmer公司；透析膜（44 mm，截留分子质量6 ku）：上海国药集团化学试剂有限公司；UV－2800型紫外－可见分光光度计：尤尼柯（上海）仪器有限公司。

由Design Expert软件分别对蛋白提取率与THA结果进行二次回归拟合分析，得到Y1（蛋白提取率）及Y2（THA）对自变量的多项式模型方程。

值得说明的是,关于为什么上述斜向垂直环流圈在某一时段能够形成而在另一时段不能形成的原因则还需进一步探索。

由表3可知，Y1模型方程的P值小于0.001，Y2模型方程的P值小于0.05，表明模型方程均为显著。两模型方程的决定系数（R2）分别为0.938 6与0.801 3，R2均大于0.80，可以认为方程的拟合情况较好［13－15］。因此