熊猫豆提取物抑制肿瘤活性及诱导结肠癌细胞Caco－2凋亡机制研究

胡冬梅 彭吕杨 薛照辉

（天津大学化工学院食品科学系，天津 300072）

熊猫豆提取物抑制肿瘤活性及诱导结肠癌细胞Caco－2凋亡机制研究

胡冬梅 彭吕杨 薛照辉

（天津大学化工学院食品科学系，天津 300072）

为了探究熊猫豆的抑制肿瘤活性及其诱导Caco－2凋亡的机制，采用80%丙酮浸提法制备熊猫豆粗提物，通过MTT法测定其对人结肠癌细胞Caco－2增殖的抑制效果，琼脂糖凝胶电泳、流式细胞术、酶联免疫分析等技术与方法检测细胞周期、DNA及凋亡相关蛋白相对表达量的变化。结果发现，与空白对照组相比，0.1～1.0 mg／mL熊猫豆丙酮提取物对Caco－2细胞增殖有明显的抑制作用，且呈现剂量效应关系，IC50为0.72 mg／mL。0.4、0.6、0.8 mg／mL熊猫豆丙酮提取物处理72 h后的Caco－2细胞，可以观察到典型的凋亡细胞的梯状DNA条带，细胞周期G1期延长，CytC、caspase－9、caspase－3蛋白的相对表达量均有显著上升。熊猫豆丙酮能够抑制结肠癌细胞Caco－2增殖，这种抑制作用是通过阻滞细胞周期和诱导线粒体通路介导的细胞凋亡实现的。

熊猫豆 人结肠癌细胞Caco－2 细胞凋亡 线粒体通路

结肠癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，全球每年新发病例约800万人，占所有恶性肿瘤的10%～15%，死亡率仅次于肺癌和肝癌［1］。目前，结肠癌的治疗方法仍以手术治疗、放射治疗和化学治疗为主，但手术创伤性大、恢复时间长，在很大程度上限制其应用；放射治疗和化学治疗具有非特异性的细胞毒素作用，在杀伤肿瘤细胞的同时对机体正常组织器官也会造成一定程度的损伤，在应用方面仍存在争议。食物治疗因其成本低廉、方便无毒害等优点，日益成为防癌抗癌的研究热点。因此，寻找一种对肿瘤细胞具有选择性杀伤作用，且不伤害或者尽可能低的伤害正常细胞的食物成为当下结肠癌辅助治疗的新方向。

大量试验研究表明，水果、蔬菜及杂粮中含有大量的生物活性物质，能够有效清除过剩的自由基，抑制癌细胞增殖，起到抗氧化和抗肿瘤的作用［2－3］，有助于预防由氧化损伤引起的癌症、心血管疾病、糖尿病等慢性病的发生。据报道，在美国，有1／3的致死癌症都可以通过合理的日常饮食而得到改善［4］。

熊猫豆是我国河西走廊的珍稀名贵彩色豆种。熊猫豆氨基酸种类齐全，人体不能合成的8种必需氨基酸中，除色氨酸和蛋氨酸含量稍低外，其余6种含量均较高，尤以赖氨酸含量丰富［5］。本研究以熊猫豆80%丙酮提取物为研究对象，以结肠癌细胞Caco－2为靶细胞，探究熊猫豆的抑制肿瘤活性及其诱导Caco－2凋亡的机制，旨在为将熊猫豆开发为功能食品、提升其附加价值提供一定的基础和依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

人结肠癌细胞Caco－2：南开大学生命科学学院；熊猫豆：市售。

RPMI 1640培养基、Standard FBS、0.25%胰蛋白酶－EDTA消化液、MTT、RIPA细胞裂解液：北京索莱宝科技有限公司；DNA Ladder检测试剂盒：南京建成生物工程研究所；人 caspase－3、caspase－9、CytC酶联免疫分析试剂盒：Deco。

1.2 仪器设备

显微镜BX41：奥林巴斯；酶标仪Multiskan FC、CO2培养箱 HERcell 150i：Thermo；流式细胞仪FACSAriaIII：BD；稳压稳流电泳仪 DYY－III2：北京六一仪器厂；紫外凝胶成像仪GIS－2009：上海天能有限公司。

1.3 熊猫豆提取物的制备

将熊猫豆碾碎成粉末，过60目筛，参照文献［6］，取10 g样品，与250 mL 80%预冷的丙酮混合，超声助溶，搅拌 10 min，3 500 r／min离心 5 min，收集上清，重复1次，将2次上清收集，45℃旋转蒸发至恒重后，冷冻干燥，储存至－40℃待用。经称量，熊猫豆丙酮提取物为0.125 g。

1.4 肿瘤细胞抑制试验（MTT法）

人结肠癌细胞Caco－2培养于含有体积分数为10%FBS的RPMI－1640培养基内，置于37℃，5%CO2培养箱中。细胞生长至对数期用0.25%胰蛋白酶－EDTA消化传代。

参照文献［7］，取对数期细胞，调整细胞密度为1×105个／mL。将细胞悬液接种于 96孔板中，每孔100μL，置于CO2培养箱中培养6～8 h至其完全贴壁。小心地吸去原培养液，分别加入不同浓度的用完全培养基配制的样品提取物（0.1～1.0 mg／mL）100μL，对照孔中加入100μL完全培养基，设置3个复孔，继续培养72 h。弃去培养液，每孔中加入MTT（0.5 mg／mL）溶液，CO2培养箱中孵育4 h后，每孔中加入150μL二甲基亚砜，震荡10 min使紫色结晶溶解，用酶标仪在570 nm测每孔的吸光度。按照以下公式计算细胞生长增殖率。

1.5 DNA ladder的检测

调整细胞密度为2.5×105个／mL，接种于6孔板，每孔2 mL，将细胞置于CO2培养箱中培养至其贴壁，分别加入 0.4、0.6、0.8 mg／mL熊猫豆提取物200μL，以不含样品的培养基作为空白对照，培养72 h后收集细胞。采用DNA Ladder检测试剂盒，按照说明书的方法提取DNA。2%琼脂糖凝胶电泳，5 V／cm，1 h，EB染色，紫外凝胶成像仪下观察拍照。

1.6 流式细胞术检测细胞周期

细胞培养和样品处理方法如前面所述，72 h后收集细胞，按照细胞周期试剂盒说明，1 800 r／min离心5 min，弃上清；PBS洗涤细胞2次，1 800 r／min离心5 min，弃上清；加入5 mL 70%冰乙醇，混匀后－20℃固定过夜；2 200 r／min离心5 min弃上清，PBS洗涤。每管样品加入0.5 mL PI染色液，混匀室温避光反应30 min，1 h内上流式检测。

1.7 CytC、caspase－9、caspase－3蛋白相对表达量的测定

CytC、caspase－9、caspase－3蛋白相对表达量利用Deco酶联免疫检测试剂盒测定。细胞培养方法和样品处理方法同上所述。收集经熊猫豆提取物处理72 h后的Caco－2细胞，用RIPA细胞裂解液裂解细胞，收集总蛋白，参照试剂盒说明书进行Elisa操作，用酶标仪在450 nm波长处读取吸光度。绘制标准曲线，并根据标准曲线计算处理后细胞内3种凋亡蛋白的相对表达量。

1.8 统计学分析

采用SPSS 18.0数据处理软件进行统计学分析。单因素方差分析，两两比较采用Duncan检验，以P＜0.05为具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 熊猫豆提取物对Caco－2增殖的抑制作用

由图1可以看出，与空白对照组相比，在所选质量浓度范围内（0.1～1.0 mg／mL），随着熊猫豆提取物浓度的增加，结肠癌细胞Caco－2增殖率逐渐降低，且呈现明显的剂量效应关系（P＜0.05）。当熊猫豆提取物质量浓度为1.0 mg／mL时，熊猫豆提取物对Caco－2细胞增殖的抑制率达到57.75%，IC50为0.72 mg／mL。因此选取 0.4、0.6和0.8 mg／mL 3个质量浓度进行后续细胞凋亡机制研究。

图1 熊猫豆丙酮提取物对结肠癌细胞Caco－2的抑制作用

2.2 琼脂糖凝胶电泳检测DNA

细胞凋亡时核酸内切酶被激活，选择性降解染色质DNA，形成50～300 bp大片段，进而核小体连接处断裂，形成180～200 bp或其整数倍的DNA片段，经过提取和纯化后，通过琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色呈现出梯状条带（DNA Ladder），而正常细胞DNA由于其未被降解而只显示总DNA一条特征条带，以此判断细胞凋亡的发生。

由图2可以看出，未经处理的空白对照组细胞DNA，只显示一条明亮的条带，且由于其片段较大，迁移率低，因此停留在点样孔附近。而经熊猫豆提取物诱导后的Caco－2细胞，其DNA发生不同程度的断裂，电泳图中呈现明显的梯状条带，且DNA降解程度与熊猫豆浓度呈正相关，浓度越大，DNA降解程度越明显。提示熊猫豆提取物可以诱导结肠癌细胞Caco－2凋亡。

图2 熊猫豆丙酮提取物处理后Caco－2细胞DNA电泳图谱

2.3 流式细胞术检测细胞周期

PI，即碘化丙锭，可以与细胞内DNA和RNA结合，采用RNA抑制剂将RNA消化后，通过流式细胞术检测到的与DNA结合的PI的荧光强度直接反映了细胞内DNA含量的多少。PI染色后，假设G0／G1期细胞的荧光强度为1，而含有双份基因组DNA的G2／M期细胞的荧光强度的理论值为2，正在进行DNA复制的S期细胞的荧光强度为1～2之间。凋亡细胞由于细胞核发生浓缩以及DNA片段化导致部分基因组DNA片段在染色过程中丢失，因此凋亡细胞经PI染色后成明显的弱染，荧光强度小于1，在流式检测的荧光图上出现Sub－G1峰，即凋亡峰。

图3 熊猫豆丙酮提取物处理后Caco－2细胞周期图

由图3可以看出，Sub－G1峰所代表的凋亡峰所占比例随熊猫豆作用浓度增大而增加。未经熊猫豆处理的空白组细胞，自然凋亡率为0.39%，而经熊猫豆提取物（0.4、0.6、0.8 mg／mL）作用后，凋亡程度明显变大，其凋亡率分别为0.61%、1.08%、1.35%，呈现明显的剂量－效应关系，且G1期所占比例随着诱导物浓度的增加而增大，因此可以得出，经熊猫豆提取物处理后，细胞被阻滞在G1期，DNA复制延迟，诱导细胞凋亡。

2.4 CytC、caspase－9、caspase－3蛋白相对表达量的测定

由图4可以看出，经熊猫豆提取物处理72 h后，凋亡蛋白CytC、caspase－9、caspase－3的相对表达量均有明显提高，且在所选浓度范围内，呈现剂量效应关系（P＜0.05）。未经诱导的空白对照组，CytC、caspase－9、caspase－3的表达量分别为（3.29±0.79）nmol／L、（0.01±0.00）ng／L和 （0.46±0.08）ng／mL，经熊猫豆提取物作用后，CytC的表达量分别提高了4.71、5.49、7.11倍，caspase－9的表达量分别提高了2.75、21、112.5倍，caspase－3的表达量分别提高2.26、5.34、8.13倍。

图4 熊猫豆丙酮提取物处理后Caco－2细胞不同蛋白的相对表达量

3 讨论

近年来大量研究表明，豆类中含有丰富的生物活性物质，经常食用豆类可以有效地降低结肠癌死亡的风险［8］。Dong等［9］研究结表明，黑豆皮丙酮提取物能够抑制HepG2、MCF－7和Caco－2细胞的增殖。镰形棘豆总黄酮对5种人癌细胞株也呈现不同程度的抑制效果，并存在剂量效应关系［10］。但这些研究仅限于豆类提取物抑制肿瘤的活性研究，对于如何抑制细胞增殖的机理并未阐述。本研究发现，当熊猫豆提取物质量浓度为0.72 mg／mL时，抑制率可以达到50%，说明熊猫豆对结肠癌细胞的增殖有良好的抑制作用。

许多化疗药物正是通过阻滞细胞周期进程或者诱导肿瘤细胞的凋亡发挥抗癌作用［11］。细胞周期主要分为G1、S、G2和M期4个阶段，其中G1期持续时间变异很大，多数细胞的G1期较长，是细胞增殖的准备阶段。不同诱导物对肿瘤细胞周期影响各异。山楂皮和果肉中的多酚提取物能够抑制MCF－7细胞增殖，且细胞周期阻滞在S期［12］；柑橘通过阻滞G2期实现抑制肺癌细胞增殖［13］；本研究中，熊猫豆丙酮提取物诱导后的Caco－2细胞，G1期明显延长，提示熊猫豆抑制结肠癌细胞Caco－2增殖可能是通过阻滞G1期引起的。

目前重建肿瘤细胞凋亡信号传递系统，即抑制肿瘤细胞生存基因的表达，激活死亡基因的表达成为治疗癌症的新思路［14］。线粒体通路是细胞凋亡的关键途径，大量研究表明药物可以通过线粒体通路诱导细胞凋亡［15－16］。熊猫豆丙酮提取物处理结肠癌细胞Caco－2 72 h后，存在于线粒体内、外膜之间的CytC，释放到细胞质，引起caspase家族蛋白的级联反应，从而激活核酸酶，诱导细胞凋亡。同时，核酸内切酶在诱导物作用下也特异性的从线粒体两层膜间释放，诱导DNA片段化，产生180～200 bp及其整数倍的DNA片段。CytC从线粒体释放到胞浆是线粒体通路的关键步骤，随着熊猫豆提取物浓度的增大，细胞质中CytC含量也逐渐增高，线粒体凋亡通路开启。Caspase－9是线粒体凋亡通路的起始蛋白，是线粒体通路的标志。Caspase－3是线粒体通路的下游蛋白，是执行凋亡的重要效应因子［17］。本研究中，caspase－9和caspase－3蛋白相对表达量的升高表明，熊猫豆提取物诱导结肠癌细胞凋亡可能是通过线粒体通路实现的。

4 结论

熊猫豆丙酮提取物能够抑制结肠癌细胞Caco－2的增殖，这种抑制效果可能是由于熊猫豆提取物能够阻滞G1期，延长细胞周期，诱导由线粒体通路介导的细胞凋亡实现的。本结果为熊猫豆作为结肠癌辅助治疗食品用于后续动物实验及临床治疗提供了参考价值，也为其进一步开发利用提供了依据。

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Anti－Cancer Activity of Panda Bean Extract and Apoptosis－Inducing Mechanism Against Caco－2 Cells

Hu Dongmei Peng Lüyang Xue Zhaohui
（Department of Food Science，School of Chemical Engineering and Technology，Tianjin University，Tianjin 300072）

In order to research the anti－cancer activity of panda bean extract and its mechanism of apoptosisinducing against Caco－2 cells，active compounds existed in panda bean have been extracted by 80%acetone aqueous solution.The inhibitory effect of panda bean extract against colon cancer cell Caco－2 with various concentrations was determined by MTT method.PI staining has been utilized to detect by cell cycle.Agarose gel electrophoresis has been utilized to detect cell apoptosis，and apoptosis－inducing mechanism was detected by ELISA.The results showed that compared with control group，0.1～1.0 mg／mL panda bean extracts expressed a significant inhibitory effect against Caco－2 with a dose－effect relationship and IC50was 0.72 mg／mL.After treated by panda bean extracts（0.4，0.6 and 0.8 mg／mL）for 72 h，typical apoptotic cell DNA ladder could be observed.Flow cytometry analysis showed that Caco－2 cell cycle could be arrested at G1 phase and sub－G1，which symbolized that the apoptosis cell was appeared after being exposed to panda bean extract.In addition，CytC，caspase－9 and caspase－3 protein levels were significantly increased.The results suggested that panda bean extract could induce apoptosis via mitochondrial pathway.

panda bean，human colon cancer cells Caco－2，apoptosis，mitochondrial pathway

R735.3

A

1003－0174（2015）04－0006－05

国家自然科学基金（31271979）

2013－12－06

胡冬梅，女，1989年出生，硕士，天然产物化学及功能食品

薛照辉，男，1973年出生，副教授，农副资源综合利用、天然产物化学及功能食品