组织培养在高粱中的应用研究进展

刘 勇， 王良群， 杨 伟， 郝艳芳， 张 微， 白鸿雁， 张晓娟， 武 擘

(山西省农业科学院高粱研究所,山西晋中 030600)



组织培养在高粱中的应用研究进展

刘 勇， 王良群， 杨 伟， 郝艳芳， 张 微， 白鸿雁， 张晓娟， 武 擘

(山西省农业科学院高粱研究所,山西晋中 030600)

主要从胚培养、幼叶培养、茎尖培养、幼穗培养、花药培养、种子培养、幼苗培养、原生质体培养、胚乳培养等方面介绍了高粱组织培养方面的研究进展,最后对高粱组织培养的发展进行了展望。

组织培养；高粱；应用

高粱(Sorghumbicolor(L.)Moench)属于禾本科(Graminea)高粱族(Andropogoneae)高粱属(Sorghum)，是全球重要的旱粮作物之一，在非洲、亚洲、大洋洲和美洲的105个国家和地区均有种植，每年大约种植4.2×107hm2，其主产国有美国、尼日利亚、印度、墨西哥、苏丹、中国、澳大利亚和阿根廷[1]。我国是高粱种植大国，年生产能力在500万t左右，主要集中在辽宁、吉林、黑龙江、山西和内蒙古等省。其中，辽宁省23.3万hm2，吉林、黑龙江和山西各13.3万hm2，内蒙古10.0万hm2。

高粱在粮食、饲料、糖料和能源以及秸秆利用等方面，有多种值得开发的加工领域[2]。在全球粮食、能源日益短缺的情况下，发展高粱生产，必将有助于缓解这些危机[3]。但高粱育种研究面临品种遗传变异性小、遗传力低、品种改良耗时长等问题。组织培养是指在无菌条件下利用人工培养基对外植体进行培养，是进行遗传转化和植物改良研究的基本环节。对高粱组织进行培养及再生，其目的在于让外植体能够高频率地诱导出愈伤组织，建立高效的体细胞再生体系，为高粱遗传转化和细胞工程研究创造有利条件[4]。韩福光等[5]报道，最早进行高粱组织培养研究的是Strogonol，1965年，他利用高粱根和分孽节在MS培养基上添加1 mg/L 2,4-D、1 mg/L的KT、5 mg/L泛酸钙和1 mg/L抗坏血酸诱导出愈伤组织，未能获得再生植株。之后Maseltler等[6]以芽原基为外植体，在附加1～5 mg/L 2,4-D的MS培养基上诱导出愈伤组织，并获得了再生植株。此后，高粱组织培养工作不断进行。笔者根据自己的工作实践，分别从高粱组织培养胚培养、幼叶培养、茎尖培养、幼穗培养、花药培养、种子培养、幼苗培养、原生质体培养、胚乳培养等方面对组织培养在高粱中的应用进行综述，以期为我国高粱育种奠定理论基础。

1 胚培养

1.1 未成熟胚的培养高粱外植体的培养是组织培养中重要的一步，目前多以未成熟胚为主要材料。国外学者如Gamborg等[7]、Dunsant等[8-9]、Brettel等[10]、Ma等[11]、Lusardi等[12]、Rao等[13]以各类型高粱的未成熟胚为研究对象，通过组织培养诱导出愈伤组织，经过分化成功获得再生植株。其中Gamborg等[7]、Dunsant等[8-9]、Brettel等[10]各选用不同的杂交种，在现有培养基的基础上添加内源激素诱导出愈伤组织。Rao等[13]研究在MS培养基中添加2,4-D和不同浓度的天门冬酞氨(L-Asn)和脯氨酸(L-Pro)对高粱愈伤组织诱导的影响，发现高浓度的L-Asn和L-Por较低浓度的L-Asn和L-Por促进愈伤组织的诱导和分化的效果强。Ekoinn等[14]以未成熟胚为研究对象，研究在现有培养基的基础上添加其他物质对高粱再生植株诱导的影响，结果发现在MS培养基中添加1～5 mg/L 2,4-D，或添加1 mg/L IAA和0.1 mg/L KT混合物，或添加0.1 mg/L KT，或1 mg/L NAA和0.5 mg/L的6-BA混合物，或N6培养基中添加高浓度的天门冬氨酸和脯氨酸均获得胚性愈伤组织。Ma等[11]、Lusardi等[12]深入研究了不同基因型高粱在形成愈伤组织上的差异及机理。

国内学者也做了大量工作，如马鸿图[15]选取20个遗传来源不同的高粱品种，进行幼胚培养，结果得到5个未成熟胚的小盾片愈伤组织，又经过分化获得了大量再生植株。郭建华[16]以未成熟胚为对象进行愈伤组织诱导的最适处理时间及生理机理研究，结果表明，高粱未成熟胚的最适胚龄为授粉后的12～13 d，长约1.0 mm；如要提高成功率，处理时间及胚的大小十分关键，进一步研究表明再生植株后代中蛋白质含量高于对照亲本，单宁含量显著低于对照亲本。建议选取亲本时应测定蛋白质含量及单宁含量，选取蛋白质含量高、单宁含量低的品系。韩福光等[5]研究发现，未成熟胚的诱愈率在不含有盐类物质的MS培养基中比含有盐类物质的高，可达70.2%，最适处理时间为授粉后12～15 d，同时还研究不同浓度2,4-D对诱导的影响，结果表明不同浓度2,4-D诱导的结果不同，因此认为2,4-D浓度对结果有影响。白志良等[17]研究表明，幼胚诱导的成功率较低主要与胚龄相关，一般胚龄小于7 d的成功率很低，胚龄多余10 d的成功率较高。

1.2 成熟胚培养国外学者对利用成熟胚进行组织培养的研究较多。Bhaskaran等[18]首次利用高粱成熟胚诱导愈伤组织，并获得成功。此后又有学者利用成熟胚小盾片诱导成功愈伤组织，并分化得到再生植株[19-21]。Cai等[22]以高粱成熟胚的芽端为对象，诱导愈伤组织，发现在现有MS培养基的基础上，添加浓度150 mg/L L-Asn、5 mg/L KT和5种无机盐，大大增加成功率，可见添加外源物质是增加诱导成功率的有效途径。

国内对于利用成熟胚的研究较少，仅有少数学者进行相关研究。韩福光等[5]取几种高粱类型的不同外植体在MS培养基上进行愈伤组织诱导培养，发现影响外植体愈伤组织形成和生长的因素很多，结果表明，不同基因型间愈伤组织诱导率有差异，耐性(耐旱)品种形成愈伤组织能力较强，不同外植体间诱愈率差别较大，幼穗诱愈率最高88.0%，花药最低1%左右。另外，幼叶诱愈培养对盐反应敏感，在成熟胚培养过程中，其诱愈率为63.0%,并获得8棵成株。白志良等[17]研究表明，成熟胚的最高出愈率达100%。石太渊等[23]认为基因型和培养基对高粱成熟胚离体培养均有较大影响。

2 幼叶培养

对于利用幼叶诱导愈伤组织的研究国内外已有报道，Wernicke等[24]用叶龄10 d的高粱幼苗幼叶为对象，将其接种在MS培养基上，35 d后得到愈伤组织，后得到再生植株。Sairam等[25]利用8个不同遗传来源的高粱品系，选取生长18 d幼苗的幼叶，提取其叶肉细胞后，接种在添加2,4-D和NAA的MS培养基上进行液体培养，得到愈伤组织后，在MS固体培养基上接种，仅2个品种能分化得到再生植株，诱导率为25%。韩福光等[5]选取距离生长点0.1～1.0 cm的幼叶，先切成1～2 mm段，研究有盐和无盐条件下对诱导愈伤组织的影响，结果表明在有盐的MS培养基上的诱愈率小，在无盐的MS培养基上所获得的诱愈率大。在相同条件下，不同品系间诱导率也不同。上述的研究均是在MS培养基上进行的，对于其他培养基的研究未见报道。

3 茎尖培养

Nahdi等[26]选取11个不同遗传来源的高粱品系的茎尖，培养后的成功率最低为0，最高为91%，可见不同遗传背景的品系其诱导率不同，表明基因型对结果的影响巨大。Seetharama等[27]认为利用3个高粱品种的茎尖进行诱导，结果与Nahdi等[26]的类似，再生率不同，平均为14%，其中仅有2个品种的再生率为18%以上。白志良等[17]先切取长0.5 cm的切段进行诱导，其出愈率为11%左右，说明在茎尖培养中无菌芽的长度非常重要，当芽长小于2 cm时，培养效果随芽长的减小而变好，但并非越小越好，切取芽的长度还应进一步研究。

4 幼穗培养

国外学者Beretl等[28]于1980年进行幼穗培养成功。此后George等[29]、Cai等[30]和Kaeppler等[31]针对不同的材料运用相同的技术，即以幼穗为外植体诱导愈伤组织，进而获得再生植株，均获得成功。说明利用幼穗诱导愈伤组织简便易行，成功率高，植株生长速度快。

国内学者[5，17，32]也做了大量的工作，结论与之相同。其中，韩福光等[5]在几种不同高粱培养基配方基础上添加一定浓度的2,4-D和KT，与不添加2,4-D和KT的培养基相比，出愈率明显提高，由8%提高至10.0%，说明培养基的配方对结果有较大影响，并要注意取材时间。

5 花药培养

Rose[33]对不同基因型的高粱花药进行培养，仅得到白化幼苗。锦州市农业科学研究所[34]选取花药分化发育期的4分体期、单核早期、单核晚期和双核期接种，结果表明，出愈率0.55%,分化出36株绿苗，分化率为88 %。韩福光等[5]将花药接种在MS和C17培养基上，发现有些材料仅在MS培养基上得到愈伤组织，有些在MS和C17培养基上均无法得到愈伤组织，说明材料的基因型和培养基类型均对培养结果有重大影响。

6 种子培养

Maralappanvar等[35]在MS培养基中添加一定浓度的2,4-D，发现有2个品种愈伤组织诱导率较高，均在80%以上，如培养基中蔗糖含量达60 g/L以上，诱导率则更高，刘明等[36]在MS培养基中添加2,4-D和KT，同样能提高诱导率，白志良等[17]认为种子的诱愈率为28%～93%，随不同品种诱愈率有差异。

7 幼苗培养

Bhat等[21]利用萌发的无菌苗进行培养，愈伤组织诱导率仅为34.6%，且未能培养出再生植株。国外学者以无菌幼苗下的横向薄细胞层进行培养，获得成功，但试验条件很高，重复性较差[36]。

8 原生质体培养

卫志明等[37]首次报道高粱原生质体培养成功，分别利用高粱植株幼穗胚性愈伤组织建立悬浮细胞系，分离原生质体，经培养获得部分再生植株，田间的生长状况良好。

9 胚乳培养

田立忠等[38]利用高粱未成熟胚乳在含有BA或2,4-D与KT组合的培养基上诱导启动，诱导形成愈伤组织的适宜激素有以下3种：①2,4-D0.5 mg/L，NAA0.2 mg/L，BA0.7 mg/L，KT4 mg/L；②NAA0.5 mg/L，ZT1 mg/L；③2,4-D0.5 mg/L，KT1 mg/L，说明胚乳愈伤组织有较强的分生能力。

10 展望

高粱组织培养的成功受到许多因素的影响。不同基因型、不同培养基均存在差异；研究表明幼胚是理想的外植体,但取材有时间、部位限制；培养基中添加的外源物质也影响高粱愈伤组织诱导与再生。因此,必须对细胞内外多种调控因子的机理作深入研究,以最终揭示高粱再生细胞分化过程的本质。

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Application Progress of Tissue Culture in Sorghum

LIU Yong, WANG Liang-qun, YANG Wei et al

(Sorghum Institute of Shanxi Academy of Agricultural Sciences, Jinzhong, Shanxi 030600)

The research progress of sorghum tissue culture was introduced from aspects of embryo culture,young leaf culture,shoot tip culture,immature inflorescence culture,anther culture, seed culture,seedling culture,protoplast culture,endosperm culture. The development of sorghum tissue culture was forecasted.

Tissue culture; Sorghum; Application

刘勇(1976- )，男，山西榆社人，助理研究员，从事高粱新技术育种研究。

2015-03-05

S 514

A

0517-6611(2015)10-031-03