动态浊度法鲎试剂在23价肺炎球菌多糖疫苗中间产品内毒素检测中的应用探讨

尚玥 于荣清 陈文敏 鲍锦库

(1.四川大学生命科学学院 四川成都 610064;2.成都生物制品研究所有限责任公司 四川成都 610023)

23价肺炎球菌多糖疫苗含有经提纯的23种肺炎球菌荚膜多糖,能覆盖感染肺炎球菌占比约90%的23种血清型人群。内毒素是目前医药工业中最普遍和最主要的外源性热源,控制内毒素污染就等于控制热源污染。因此内毒素的检测在多糖疫苗的生产过程中尤为重要。在适宜的条件下细菌内毒素能激活鲎试剂中的凝固酶原,使鲎试剂产生凝集反应形成凝胶。细菌内毒素浓度越高浊度变化越快,浊度变化符合二阶反应动力学曲线。借助仪器进行动态浊度法试验,可精确地检测出供试品样品的浊度。

1 材料与方法

1.1 供试品和仪器

供试品为PN2 T-CZ20130801,PN2 T-JZ20130801,PN17F T-CZ20130801,PN17F T-JZ20130801(均由国药集团成都生物制品研究所提供)。仪器为ATi细菌内毒素动态检测仪。

1.2 鲎试剂灵敏度复核试验

用细菌内毒素检查用水作为阴性对照,再梯度稀释制成0.03125 EU/mL、0.0625 EU/mL、0.125EU/mL、0.25 EU/mL、0.5 EU/mL、1 EU/mL、2 EU/mL的标准溶液,依次加入已准备好的鲎试剂中,放入ATi细菌内毒素动态检测仪中运行软件进行检测。重复试验3次。

1.3 干扰试验(回收率试验)同上选取0.03125 EU/mL、0.25 EU/mL、2 EU/mL的内毒素标准溶液作为标准曲线。将细菌内毒素标准品按照1 EU/mL、5 EU/mL和10 EU/mL的浓度作为样品进行稀释,放入ATi细菌内毒素动态检测仪中运行软件进行检测。重复试验3次。

1.4 供试品的内毒素检查

制备标准曲线(同上),将供试品稀释6倍作为样品放入ATi细菌内毒素动态检测仪中运行软件进行测定。

2 结果

2.1 鲎试剂灵敏度复核试验结果

根据药典要求,相关系数|γ|≥0.980;阴性对照的反应时间(TD)大于标准曲线最低浓度的反应时间(Tλ),试验结果符合规定要求,见表1。

表1 鲎试剂灵敏度复核试验结果

2.2 干扰试验(回收率试验)结果

重复试验三次,根据药典要求, |γ|≥0.980; TD大于Tλ,回收率R满足50%≤R≤200%,变异系数CV%<10%。试验结果符合规定要求,见表2。

表2 干扰试验(回收率试验)重复试验

2.3 供试品的内毒素检查结果γ=-0.9968;TD>3600s, Tλ=1693.333s,TD>Tλ,肺炎球菌粗制、精制多糖检测细菌内毒素应小于300EU/mL,均符合药典规定要求,见表3。

表3 供试品内毒素检查结果

3 讨论

鲎试验法已在医药工业上成为注射药品生产质控的最好方法之一。其优点在于取样方便、微量,操作简便迅速,灵敏、准确,使得药品生产过程热原质控能实现动态监控和事前控制。同时由于温度、pH值以及人员操作因素等影响,鲎试剂法存在一定比例的假阳性,经过本试验的灵敏性测试及干扰性试验,在已确立的23价肺炎球菌多糖疫苗内毒素检测中进一步规范了试验要求,对23价肺炎球菌多糖疫苗的质量检测提供了依据。

[1]诸衍立,张淑英,张淑梅.浅议鲎试剂法中不容忽视的几个问题[J].中国医院药学杂志,2000,20(1).

[2]王炜红,杨晶雪.细菌内毒素检测试验方法的建立[J].中国消毒学杂志,2011,28(2).