葛根芩连汤对人口腔黏膜上皮细胞增殖的影响

王 丹 魏润生 高海涛 孟 贺 白宇宏 彭 伟

1（华北理工大学 口腔医学院，唐山063000）

2（唐山市工人医院，唐山063000）

复发性阿弗他溃疡又称复发性口腔溃疡，是最常见的口腔黏膜溃疡类疾病，病因不明，可能与免疫、遗传、系统性疾病、感染、环境等因素有关［1］。临床上，除积极寻找可能的相关诱因外，药物治疗多见于局部采用糖皮质激素，但长期应用副作用显著。中草药是祖国医学的瑰宝，治疗各种慢性疾病越来越受到重视。葛根芩连汤是经典古方之一，来源于东汉末年张仲景所著《伤寒论》，有外疏内清、表里同治之效。因其药味较少，作用明确，是中医药的经典方剂，一直是研究的热点。其剂型多为饮剂。为了增加其生物利用度及临床需要，笔者尝试了将葛根芩连汤提取液作用于体外培养的口腔黏膜上皮细胞，观察其对体外培养的口腔黏膜上皮细胞增殖活性的影响，为将其制成膜剂等局部给药剂型治疗复发性阿弗他溃疡等口腔黏膜疾病提供理论依据。

1 材料与方法

1．1 组织来源

口腔黏膜来自河北联合大学博创口腔医院口腔颌面外科拔除的低位阻生的阻生齿上覆盖的正常牙龈黏膜。

1．2 主要试剂及仪器设备

角化细胞无血清培养液（keratinocyte-serum free medium，K-SFM）（Gibco，美国）；分离酶 DispaseⅡ（Gibco，美国）；胰蛋白酶（天津血研所）；四甲基偶氮唑盐（MTT）、磷酸盐缓冲盐（PBS）、二甲基亚砜（DMSO）均购自美国Sigma公司；Triton X-00（华美生物工程有限公司）；标准型96孔细胞培养板（美国Corning公司）；葛根芩连汤合剂：由葛根（批号：1110035）、黄 芩 （批 号：1202152）、黄 连 （批 号：1111019）、炙甘草（批号：1112083）中药配方颗粒（广州一方制药有限公司）组成。

1．3 口腔黏膜上皮细胞原代培养

取材：手术铺巾、严格消毒下所取的低位阻生的阻生齿上覆盖的正常牙龈黏膜组织立即用无菌生理盐水冲净，放于新鲜配制的PBS缓冲液中，半小时内移入超净工作台。在超净工作台内将组织标本用PBS荡洗干净，用含有双抗溶液（青霉素、链霉素浓度均为100U／ml）的PBS（2g／L）浸泡10min。取出标本用眼科剪剪去部分黏膜下组织，并修剪组织块。

分离上皮：将黏膜组织放入0．25%的DispaseⅡ（中性蛋白酶）中，置于4℃冰箱中消化18h，取出后用眼科镊将上皮从黏膜下组织上分离下来。

原代培养：将口腔黏膜上皮用PBS冲洗2遍，加入到0．125%胰蛋白酶与0．02%EDTA等体积混合消化液中37℃下消化5min，轻轻吹打，用含10%胎牛血清的PBS终止消化，制成细胞悬液，加入PBS洗涤，离心500r／min×10min，重复三次，尽可能消除胰蛋白酶对细胞的影响。再次离心后弃上清，在K-SFM中重悬，血球计数板计数。细胞悬液以2×105个／cm2的密度接种于培养板中，置于37℃、体积分数5%CO2培养箱中静置培养。第2d首次换液，以后隔天换液1次。

传代培养：当细胞达到80%～90%汇合时，吸去培养液，0．125%胰蛋白酶与0．02%EDTA等体积混合消化液消化细胞。镜下观察细胞突起回缩变圆时终止消化，吸管反复吹打，离心500／min×10min，无血清培养基重悬细胞沉淀，细胞悬液以1∶2的比例接种于培养皿中继续培养，以后隔天换液1次。倒置相差显微镜下观察原代及传代后细胞形态变化及生长增殖情况。

1．4 MTT法检测体外培养的口腔黏膜上皮细胞的增殖活性

取生长良好的第2代培养细胞，以1×105的细胞浓度接种于96孔板，孵育3d，随机分为5个实验组和1个对照组，每组选5个孔。实验组分别加入经无血清培基稀释的5个浓度梯度的葛根芩连汤液（2%、10%、15%、20%、50%）各100μl，对照组只加无血清培基，培养5d后，每孔加 MTT 100μl继续培养4h，弃孔内液体及MTT，加入二甲基亚砜100 μl，振荡10min，在分光光度仪上于492nm波长下测OD值，取每组5孔平均值，比较5种浓度的葛根芩连汤提取液对黏膜上皮细胞增殖活性的影响。

1．5 统计学方法

采用SPSS 17．0统计软件，检测结果以均数±标准差（±s）表示，P＜0．05为差异有统计学意义，应用单因素方差分析方法对结果进行统计学分析。

2 结果

2．1 观察细胞生长情况

倒置相差观察显微镜下，接种2d的口腔黏膜上皮细胞已贴附于瓶底，呈多角形或扁平椭圆形，胞核清晰位于细胞中央。培养5d时，细胞生长明显加快，可见核分裂相。培养10d时，细胞已逐渐融合成片，如铺路石状镶嵌。细胞生长铺满瓶底80%～90%时进行传代，传代细胞贴壁比原代细胞快，无复层生长，仍呈多角形 （见图1）。

2．2 葛根芩连汤对体外培养的口腔黏膜上皮细胞增殖活性的影响

经酶标仪在492nm处的读数，对照组的OD值为0．033；实验组2%、10%、15%、20%、50%OD 值分 别 为 0．047，0．063，0．121，0．041，0．035 。 在15%浓度下增殖活性吸光度（OD）值明显高于其他浓度和对照组（P＜0．05）。而在2%、10%、20%、50%浓度下增殖活性吸光度（OD）值虽高于对照组，但无统计学意义（P＞0．05）（见表1）。

图1 第二代培养的人口腔黏膜上皮细胞（倒置相差显微镜，×100）Figure 1 Human oral mucosal epithelial cells in second passage（inverted phase-contrast microscopy，×100）

表1 不同浓度葛根芩连汤对上皮细胞增殖的影响Table 1 Effects of Gegen Qinlian decoction on the proliferation in cultured human epithelial cells

3 讨论

复发性阿弗他溃疡（Recurrent Aphthous Ulcer，RAU）根据其临床特点，可分为轻型、重型、疱疹型三种，其中轻型占80%左右。RAU具有周期性、复发性、自限性特征，溃疡灼痛明显［1］。目前病因及致病机制尚不明确，所以目前无根治的方法，局部用药主要以促进溃疡愈合、消炎止痛、防治继发感染为原则，中医及中西医结合治疗RAU是我国目前黏膜病治疗的重要内容。本次研究主要观察使用葛根芩连汤是否能促进口腔黏膜上皮细胞的增殖，也就是能否促进上皮层的愈合，为中药治疗复发性阿弗他溃疡提供新思路。

葛根芩连汤为医圣张仲景的名方之一，由葛根、黄芩、黄连与炙甘草4味中药组成。分别为：葛根半斤，甘草二两（炙），黄芩三两，黄连三两。葛根芩连汤广泛用于治疗菌痢、肠伤寒等内、儿、外、妇、五官科疾患，取得了明显疗效。近年来国内外医学家通过实验研究证明葛根芩连汤具有解热、抗菌、抗病毒、解痉、抑制胃肠运动、抗缺氧、抗心律失常、增强机体免疫功能等药理作用［2］，但其对细胞增殖的作用研究较少。

本研究成功建立上皮细胞体外培养体系，为研究葛根芩连汤对细胞增殖所起的药理作用奠定了基础。微生物的污染、人类黏膜组织来源的限制、上皮细胞不能贴壁以及所需营养成分复杂等是上皮细胞培养成功的主要影响因素［3］。在实验过程中，我们采用了DispaseⅡ酶和胰酶结合的方法获得了单一的上皮细胞，并用添加了一定浓度的牛垂体提取物和EGF的无血清培养基成功地进行了口腔上皮细胞的培养。在实验过程中，临床取得组织后迅速置于PBS液中，移入超净工作台。所有操作尽量快速，上皮组织要尽量避免在空气中暴露时间过长。在把组织放入0．25%的DispaseⅡ酶前，要用PBS尽量冲洗掉残余的消毒液，避免抗生素对组织的影响。DispaseⅡ酶作用温和，在0．25%的DispaseⅡ酶浓度下消化组织块18～20h可完整分离上皮和其下的结缔组织，避免了成纤维细胞的污染并且保留了增殖旺盛的基底细胞层。组织来源的不足是本次研究数次失败的主要原因，尽管培基中添加有生长因子，但只有达到一定密度细胞才能自我维持［4］，细胞自身分泌的生长因子才能促使周围细胞不断分裂增殖，我们在较高密度接种细胞时取得了成功。贴壁前几天要尽量减少观察次数，可以减少培养液对细胞的冲刷作用，保证细胞顺利贴壁。细胞不能贴壁还可能是由于胰酶消化了细胞表面的蛋白质，使细胞的通透性增高造成的，在实验中采用了低浓度0．125%胰蛋白酶与EDTA的混合液消化，500r／min的低速离心，并用PBS重复荡洗两次，尽量消除胰酶和离心对细胞的伤害。为避免抗生素对细胞生长和形态的影响，未在培基中添加抗生素，结果表明，标本的消毒处理和实验过程中的无菌操作是可以避免污染的。直接将中药提取液加入到体外细胞培养体系中，易受到各种因素的影响。因此，在中药提取液的制备过程中，严格把关中药的煎煮、过滤、浓缩、醇沉、活性炭脱色、微孔滤膜除菌、调节PH值等程序。

葛根芩连汤目前主要剂型有片剂、胶囊剂、微丸、口服液、颗粒剂五种，汤剂为原始剂型。膜剂是60年代开始发展起来的新剂型，并很快应用于口腔溃疡。口腔溃疡膜能在水浸后成为溶胶，粘附在粘膜表面，膜内药物释放持久，保持局部药物较高浓度，同时能使病损部位得到机械性保护，从而有效减轻患者痛苦、提高疗效。纯中药的口腔溃疡膜较少，多为加入了抗生素或皮质激素。本次研究在细胞培养的基础上证实了葛根芩连汤对口腔黏膜上皮细胞有促增殖的效果，希望在不久的将来制成葛根芩连汤膜剂，进一步应用于复发性阿弗他动物溃疡模型，为研究人类RAU的发病机制及治疗提供理论基础。

［1］ 陈谦明，主编．口腔黏膜病学［M］．人民卫生出版社．

［2］ 陈丽红，唐于平，王强．葛根芩连汤的现代研究进展［J］．中草药，2010，41（4）：附8-附11

［3］ 胡秀莲，王兴，林野，邱立新．人口腔黏膜角化上皮细胞的体外培养及生物学特性研究［J］．中国口腔颌面外科杂志，2004，，2（3）：173-176．

［4］ Reid CB，Cloos J，Snow GB，et al．A simple and reliable technique for culturing of human oral keratinocytes and fibroblasts．Acta Otolaryngol，1997，117（4）：628-633．

［5］ 路又璐，秦健中．17味中药对培养的表皮细胞增殖的影响［J］．临床皮肤科杂志1996，25（4）：202-204．