钟基因Per2和肿瘤相关钟控基因在金黄地鼠口腔颊黏膜癌变不同阶段的昼夜节律改变

叶华 杨凯 谭雪梅 赵丹 吕晓强 王青青,2

1.重庆医科大学附属第一医院口腔颌面外科；2.口腔疾病与生物医学重庆市重点实验室，重庆 400016

在长期的生物进化中，地球上的生物形成了内源性的时间调节系统，即昼夜节律时钟[1-2]。目前研究[3-4]表明，哺乳动物体内的许多生命活动，如睡眠与清醒、激素分泌和免疫活动等均表现出以近24 h为周期的昼夜节律波动，这种波动是由钟基因的昼夜节律性表达控制的。进一步研究[2,5]发现，哺乳类动物基因组中约有5%～10%的基因受到钟基因的调控，也表现出以24 h为周期的昼夜节律波动，这些基因被称为钟控基因。钟基因和钟控基因的昼夜节律表达对维持正常生命活动高度协同有序具有重要作用[5-6]。

Per2（Period 2）基因是重要的钟基因，在正常细胞中的表达具有昼夜节律性[1,7]；同时Per2也是一种抑癌基因，在前列腺癌、结肠癌、黑色素瘤等多种实体癌细胞中低表达[8-9]。许多与肿瘤发生发展相关的重要基因为钟控基因，受到了钟基因Per2的调控[9-11]。Per2通过调控下游众多肿瘤相关基因影响细胞的增殖、凋亡和肿瘤新生血管生成，与癌症的发生发展密切相关[10-11]。但目前尚不清楚钟基因Per2与肿瘤相关钟控基因在癌症发生发展不同阶段昼夜节律的动态变化情况。本研究通过检测钟基因Per2和肿瘤相关基因血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、Ki67、c-Myc和P53在金黄地鼠颊黏膜癌变不同阶段的昼夜节律表达变化规律，分析该基因与癌变的关系，对深入研究癌症发生发展的机制以及基于恢复生物昼夜节律的癌症治疗提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 主要材料

1.1.1 仪器与试剂 二甲基苯并蒽（dimethylbenzanthracene，DMBA）（Sigma公司，美国）。RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒（TaKaRa公司，日本）。冷冻低温离心机（Z223MK-Z型，HERMLE公司，德国），核酸蛋白分析仪（UV-GeneQuant型，瑞典安玛西亚公司）。聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）试剂盒（TaKaRa公司，日本）。梯度PCR仪（BioRad公司，美国），荧光定量PCR仪（S1000TMThermal Cycler型，BioRad公司，美国）。光学显微镜（BX51型，Olympus公司，日本）。

1.1.2 实验动物 无特定病原体级叙利亚金黄地鼠（北京维通利公司）90只，雄性，6～7周龄，质量90～120 g。所有动物实验操作程序均经过重庆医科大学实验动物使用管理委员会批准。

1.2 实验方法

1.2.1 DMBA诱导金黄地鼠颊黏膜癌变动物模型的建立 90只叙利亚金黄地鼠随机分笼饲养，每笼5只，垫料、饲料和饮水均经灭菌处理，室温为（24±1） ℃，空气湿度为60%±10%，置于标准化12 h光照和12 h黑暗环境中饲养3周以同步化金黄地鼠的昼夜生活习性。时间以开灯后时间（hours after light onset，HALO）作为参考，0 HALO为开灯时间，12 HALO为关灯时间。在第3周最后1 d，在24 h内4、8、12、16、20和24 HALO共6个不同时间点采用颈椎脱位法处死30只金黄地鼠，每个时间点处死5只，获取其左侧正常颊黏膜组织（正常组）。余下的60只地鼠继续置于12 h光照和12 h黑暗环境中饲养，每周1、3、5将地鼠固定于自制鼠盒上，拉开上下牙列，用5号油画笔于左侧颊黏膜涂抹0.5%DMBA丙酮液，分别于涂抹DMBA第6周和第14周的最后1 d，在24 h内的4、8、12、16、20和24 HALO共6个不同时间点用颈椎脱位法各处死5只金黄地鼠，获取左侧颊部组织。

根据不同的诱导时间，第6周获取的组织为癌前病变组，第14周获取的组织为癌症组。每个动物所获的组织均分为两个部分，一部分用10%甲醛溶液常规固定，脱水，石蜡包埋；另一部分迅速分装于冻存管，保存在液氮中。

1.2.2 病理学检测 将获取的每块石蜡包埋组织行4 μm厚切片，行常规苏木精-伊红（hematoxylineosin，HE）染色、封片，在光学显微镜下观察组织的癌变情况。

1.2.3 实时荧光定量PCR 实时荧光定量PCR检测按试剂盒说明进行。1）组织总RNA提取：用RNA提取试剂盒提取液氮保存组织的总RNA，用核酸蛋白分析仪测定其在波长260 nm及280 nm处的光密度值，计算RNA质量浓度和纯度。2）cDNA合成：用逆转录试剂盒合成cDNA，反应体系为10 μL，37 ℃，15 min，85 ℃，5 s。3）实时荧光定量PCR反应：用Oligo7.0软件设计并合成目的基因Per2、VEGF、Ki67、c-Myc、P53以及内参基因β-actin的引物（引物序列见表1），反应体系为2×SYBR Premix Ex TaqTMⅡ 12.5 μL，浓度均为0.4 μmol·L-1的上游和下游引物各1 μL，DNA模板2 μL（相当于100 ng），灭菌灭酶蒸馏水8.5 μL。反应液总体积为25 μL。反应条件均为95 ℃预变性1.5 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火延伸30 s，扩增40个循环；60 ℃延伸时采集荧光信号。采用2-ΔΔCt法计算Per2、VEGF、Ki-67、c-Myc和P53 mRNA的表达。实验共进行3次。

1.3 统计学分析

用SPSS 17.0统计学软件分析各目的基因在每个癌变阶段各6个时间点的差异性表达，检验水准为双侧α=0.05。用Time Series Analysis Cosinor 6.3软件行单余弦分析，以P＜0.05为目的基因表达存在昼夜节律性，并绘制余弦曲线。昼夜节律特征以中值、振幅和峰值位相时来反映，其中中值为曲线对应的所有数据的平均值，振幅表示余弦曲线振荡高于或低于中值的程度，峰值位相时表示节律达到顶峰时的时间。

表1 各基因实时荧光定量PCR引物序列Tab 1 Primers used for real-time PCR amplification of gene expression

2 结果

2.1 病理学检查

病理学检查显示：正常组30例均为正常颊黏膜组织；癌前病变组30例中有25例表现为中度不典型增生，3例为轻度不典型增生，2例为重度不典型增生；癌症组30例均为鳞状细胞癌组织（图1）。

图1 正常颊黏膜、癌前病变及癌症组织的病理学检测 HE × 400Fig 1 Pathological observation of normal buccal mucosa, precancerous lesions and cancer HE × 400

2.2 钟基因Per2 mRNA在颊黏膜癌变不同阶段表达的昼夜节律改变

Per2 mRNA在正常组、癌前病变和癌症组昼夜6个不同时间点之间表达的差异均有统计学意义（表2）。余弦分析表明：Per2 mRNA在正常组、癌前病变组和癌症组中的表达均有昼夜节律性（表3），基因表达的余弦拟合曲线见图2。结合表2、表3和图2分析昼夜节律特征如下。1）中值和振幅：Per2 mRNA表达的中值和振幅在癌前病变组和癌症组中均低于正常黏膜组（P＜0.05），癌症组中值低于癌前病变组（P＜0.05），但振幅在癌症组和癌前病变组中无明显差异（P＞0.05）。2）峰值位相时：Per2 mRNA癌症组的峰值位相时与正常组大致相同，但癌前病变组则较正常组提前了2.94 h。

表2 Per2、VEGF、Ki67、c-Myc和P53 mRNA在正常颊黏膜、癌前病变和癌症组织中24 h内6个不同时间点的mRNA相对表达量Tab 2 The mRNA relative expression of Per2, VEGF, Ki67, c-Myc and P53 in normal buccal mucosa, precancerous lesions and cancer at 6 different time points in 24 h

表3 Per2、VEGF、Ki67、c-Myc和P53 mRNA在正常颊黏膜、癌前病变和癌症组织中mRNA表达的昼夜节律变化特征Tab 3 The circadian rhythm characteristics of Per2, VEGF, Ki67, c-Myc and P53 mRNA expression in normal buccal mucosa,precancerous lesions and cancer

2.3 癌症相关基因mRNA在颊黏膜癌变不同阶段表达的昼夜节律改变

VEGF、Ki67和P53 mRNA在正常组、癌前病变组和癌症组昼夜6个不同时间点之间表达的差异均有统计学意义（P＜0.05）；c-Myc mRNA在正常组、癌前病变组昼夜6个不同时间点表达的差异有统计学意义（P＜0.05），但在癌症组的差异无统计学意义（P＞0.05）（表2）。

各基因的余弦拟合曲线见图2，结合图2和表2进行余弦分析，可以发现以下规律：VEGF、P53和c-Myc mRNA在正常组、癌前病变和癌症组中的表达具有昼夜节律性（P＜0.05）；Ki67 mRNA在正常组和癌前病变组中的表达具有昼夜节律性（P＜0.05），但在癌症组中不具有昼夜节律性（P＞0.05）。

图2 Per2、VEGF、Ki67、c-Myc和P53 mRNA分别在正常颊黏膜、癌前病变和癌症组织表达的昼夜变化的余弦拟合曲线Fig 2 Cosine fitted curves of Per2, VEGF, Ki67, c-Myc and P53 mRNA expression in normal buccal mucosa, precancerous lesions and cancer

各基因的昼夜节律特征分析如下。1）中值：VEGF和c-Myc mRNA表达的中值在癌前病变组和癌症组中均高于正常组，且癌症组的中值明显高于癌前病变组；Ki67 mRNA表达的中值在癌前病变组中高于正常组；P53 mRNA表达的中值在癌前病变组和癌症组中均低于正常组，且癌症组的中值低于癌前病变组，以上差异均有统计学意义（P＜0.05）。2）振幅：VEGF和c-Myc mRNA的振幅在癌前病变组和癌症组中均高于正常组（P＜0.05），但在癌症组和癌前病变组之间无明显差异（P＞0.05）；Ki67 mRNA的振幅在癌前病变组中明显高于正常组（P＜0.05）；P53 mRNA的振幅在癌前病变组和癌症组中均低于正常组，且癌症组低于癌前病变组（P＜0.05）。3）峰值位相时：VEGF mRNA的峰值位相时在癌前病变组和癌症组中较正常组分别提前3.72 h和8.89 h；Ki67 mRNA的峰值位相时在癌前病变组较正常组滞后18.28 h；P53 mRNA的峰值位相时在正常组和癌症组大致相同，但癌前病变组较正常组滞后3.40 h；c-Myc mRNA的峰值位相时在癌前病变和癌症组中分别较正常组提前3.86 h和滞后16.15 h。

3 讨论

钟基因Per2为抑癌基因，其表达的昼夜节律改变与肿瘤的发生发展密切相关[10-12]。Zieker等[1]报道，正常人口腔颊黏膜细胞中Per2的表达具有昼夜节律性。本研究进一步发现，Per2 mRNA在口腔颊黏膜癌变3个不同阶段的表达均具有昼夜节律性，Per2 mRNA表达的中值和振幅随癌变的发展而下降，证明其抑癌作用逐渐减弱，细胞出现恶性转化。从峰值位相时来看，Per2 mRNA表达峰值的出现时间在正常颊黏膜和癌症组织中大概相同，但在癌前病变阶段较正常组提前2.94 h，其机制有待深入研究。

癌症的发生发展必需依赖于肿瘤新生血管的生成[11]，VEGF在诱导肿瘤新生血管生成中起核心作用[11]。Koyanagi等[7]发现，VEGF mRNA在小鼠皮下移植肉瘤细胞中的表达具有昼夜节律性，同时在荷瘤鼠的肝细胞和血浆中VEGF蛋白的表达也具有昼夜节律性。本研究发现，VEGF mRNA在口腔颊黏膜癌变3个不同阶段的表达均具有昼夜节律性，其中值和振幅随癌症的发展而升高，促进肿瘤新生血管的形成和肿瘤的发展；另外VEGF mRNA的峰值位相时随癌症的发生发展而不断提前，这为基于VEGF为靶点的癌症治疗用药时间提供了参考。

P53为抑癌基因，其表达水平增高能抑致肿瘤生长和诱导细胞凋亡，Ki67和c-Myc是细胞增殖基因，其表达水平增高能增加细胞的增殖水平[10]。本研究表明：P53和c-Myc mRNA在口腔颊黏膜癌变3个不同阶段的表达均具有昼夜节律性，但Ki67 mRNA仅在正常组和癌前病变组具有昼夜节律性，癌症组表现为昼夜节律紊乱。总体来看，随着癌症的发生发展，P53 mRNA表达的中值和振幅逐渐降低，表明其抑癌作用和诱导细胞凋亡能力逐渐减弱，而Ki67和c-Myc mRNA的中值和振幅逐渐升高，细胞增殖水平逐渐增强，导致细胞增殖和凋亡的平衡失调。从峰值位相时来看，P53 mRNA的峰值位相时在正常组和癌症组中基本相同，但癌前病变组较正常组滞后3.40 h，Ki67在癌前病变组较正常组滞后18.28 h，c-Myc在癌前病变组和癌症组较正常组分别提前3.86 h和滞后16.15 h。由此推测，细胞凋亡基因P53和细胞增殖基因Ki67、c-Myc峰值位相时在癌变过程中的不协同改变进一步加重了细胞增殖和凋亡的平衡失调，从而促进癌症的发生发展。

本研究发现，随着癌症的发生发展，钟基因Per2和肿瘤相关基因VEGF、Ki-67、c-Myc和P53表达的中值、振幅和峰值位相时均发生了明显改变，这为从基因的昼夜节律改变的角度来探索癌症发生机制以及基于恢复生物昼夜节律的癌症治疗提供了新的思路。

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