微波辅助提取玉米蛋白粉中的玉米黄色素研究

赵文扬， 康明丽， 郭小磊， 王蕾娜

（河北科技大学生物科学与工程学院，河北石家庄 050018）

玉米蛋白粉也称为玉米麸质粉，是加工玉米淀粉的副产物之一（赵文扬等，2014），其中主要成分是玉米醇溶蛋白和玉米黄色素。玉米黄色素是主要由β-胡萝卜素、玉米黄素（3-3’-二羟基-β-胡萝卜素）、黄体素（3-3’-二羟基-α-胡萝卜素）和隐黄素（3-羟基-β-胡萝卜素）组成的类胡萝卜素混合物，其中双羟基胡萝卜素的比重最大，其次是单羟基胡萝卜素 （Quackenbush等，1970）。玉米蛋白粉中类胡萝卜素含量为100～300 mg/kg（李丽和崔波，2010）。研究表明，玉米黄色素可以增强免疫力，降低患癌症、心血管疾病、眼部疾病和白内障等风险（孙晓芳等，2010；吴静等，2009；孙震等，2006a、b）。 提取玉米蛋白粉中玉米黄色素的方法主要有混合有机溶剂萃取、超临界CO2萃取、微波法等（周芳和郝红英，2014）。有机溶剂法使用的提取设备较为常用；超临界CO2萃取需要特殊的设备，仪器设备昂贵，而且分离步骤繁杂；微波辅助可以消除热梯度，具有速度快、能耗低、提取质量高等优点，有利于工业化大规模生产。黄琼等（2011）利用微波辅助提取玉米黄色素，提高了提取率，但是微波时间过长，会破坏玉米黄色素的结构。

因此，本试验利用分析软件Design expert 8.0.6进行Box-Benhnken试验设计，对微波提取玉米蛋白粉中玉米黄色素的提取条件进行优化，为工业化提取提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料 玉米蛋白粉：河北诚业制糖有限公司提供；β-胡萝卜素购于美国Sigma公司；无水乙醇、二氯甲烷等试剂均为市售分析纯。

1.2 仪器与设备 T6新世纪紫外可见分光光度计 （北京普析通用仪器有限责任公司）、PL203电子分析天平 （梅特勒-托利多仪器有限公司）、MP511型实验室pH计（上海三信仪表厂）、Galanz G8023 YSL-V1微波炉 （佛山市顺德区格兰仕微波炉电器有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 β-胡萝卜素最大吸收波长的确定 准确称取20 mg β-胡萝卜素，溶解于100 mL无水乙醇中。以无水乙醇做空白参比，在紫外可见分光光度计400～600 nm波长处进行扫描，确定最大吸收波长 λmax。

1.3.2 标准曲线的制作 准确称取20 mg β-胡萝卜素，配制成浓度为0.2 mg/mL的标准溶液，分别吸取1～8 mL，用无水乙醇定容至50 mL。在λmax处测其吸光度值，用最小二乘法做线性回归，得标准曲线（图1）及标准曲线回归方程。

图1 β-胡萝卜素的标准曲线

由图1可知，标准曲线的回归方程为：

y=24.128x+0.0248，相关系数R2=0.9992；

式中：y为吸光度；x为β-胡萝卜素浓度，mg/mL。

1.3.3 提取溶剂的选择 准确称取2 g玉米蛋白粉，分别溶于20 mL无水乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯等有机溶剂中，pH值调至5，静置提取1 h后过滤，在λmax处测其吸光度值并计算得率。

1.3.4 单因素试验 准确称取2 g玉米蛋白粉按料液比 1∶20～1∶4（g/mL）溶于有机溶剂（无水乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯等）中，分别调节pH值至2～13，微波功率 160、320、480、640、800 W，微波时间10～60 s。提取完成后，过滤，在λmax处测其吸光度值，计算得率。由于微波会产生大量的热，破坏色素的稳定性，所以提取时间不宜过长。

1.3.5 玉米黄色素的得率计算 在λmax处测得吸光度值，根据标准曲线求得玉米黄色素中β-胡萝卜素含量（mg/mL），利用公式计算玉米蛋白粉中玉米黄色素的提取率。

玉米黄色素的得率/（mg/g）=稀释倍数×C×V/所用的玉米蛋白粉质量（g）；

式中：C为β-胡萝卜素含量，mg/mL；V为提取液的体积，mL。

1.3.6 优化试验 在单因素试验的基础上，根据Design Expert 8.0.6进行三因素三水平的Box-Benhnken响应面试验设计，以料液比、pH值和微波设定为研究因素，以玉米黄色素的得率为响应值。

1.4 数据统计分析 试验处理重复三次，试验结果均以平行试验测定所得数据的 “平均值±标准差”表示。处理间的平均数多重比较用SPSS 17.0统计软件中的Duncan’s分析法，最小差异显著水平为5%。

2 结果与分析

2.1 最大吸收波长 由图2可见，波长扫描结果显示β-胡萝卜素在波长为446 nm处有最大吸收峰。将提取液进行波长扫描，得到最大吸收波长为446 nm。这与张梅秀等（2013）和李晓玲等（2014）的研究结果相同。

图2 β-胡萝卜素最大吸收波长的确定

2.2 提取溶剂的选择 由图3可知，用不同提取溶剂提取玉米黄色素，得率由大到小分别为：二氯甲烷＞无水乙醇＞乙酸乙酯＞氯仿＞四氯化碳＞丙酮＞石油醚＞正己烷。从图3可以看出，无水乙醇与二氯甲烷对玉米黄色素得率的影响无显著差异（P>0.05）。由于二氯甲烷和乙酸乙酯具有刺激性气味，而无水乙醇具有特殊的香味且易挥发，适用于食品加工，所以选择无水乙醇为最佳提取溶剂。李晓玲等（2014）通过溶剂筛选，选择无水乙醇作为提取溶剂提取玉米黄色素。敬思群等（2010）通过溶剂筛选，选择成本较低，易于浓缩蒸发且易回收利用的无水乙醇作为玉米蛋白粉中黄色素的提取剂。

图3 提取溶剂的选择

2.3 pH值对玉米黄色素得率的影响 由图4可知，pH值的变化对玉米黄色素得率的影响显著（P<0.05）。随着pH值的升高，玉米黄色素的得率逐渐增加，在pH为5时达到最大，随后逐渐减小。由于玉米黄色素在弱酸性和中性范围内比较稳定（敬思群等，2010），因此，提取玉米黄色素的最佳pH为5。

图4 pH值对玉米黄色素得率的影响

2.4 料液比对玉米黄色素得率的影响 由图5可知，料液比的变化对玉米黄色素得率的影响显著。随着料液比例的逐渐减小，玉米黄色素的得率逐渐增加，1∶6时得率最大，随后又减小，因此最佳料液比选择 1∶6。

图5 料液比对玉米黄色素得率的影响

2.5 微波功率对玉米黄色素得率的影响 由图6可知，微波功率的变化对玉米黄色素得率的影响显著。随着微波功率的增加，玉米黄色素的得率逐渐增加，到640 W时得率最大，640 W之后得率缓慢减小。微波加热主要是通过穿透水将能量传递到植物物料内部使细胞内温度突然升高，连续的高温使其内部压力超过细胞空间膨胀的能力，从而导致细胞破裂，细胞内的物质自由流出，传递到周围被溶解。所以在一定时间内微波功率越大传递能量就越多，植物因细胞破裂而溶出的内容物也越多。但是功率过大会分解色素（张守文和韩英，2014）。因此最佳微波功率为640 W。

图6 微波功率对玉米黄色素得率的影响

2.6 微波时间对玉米黄色素得率的影响 由图7可知，随着微波时间的延长，玉米黄色素的得率逐渐增加，达到一个最大值之后缓慢减小，可能是由于微波放热的过程中，随着微波时间的延长，微波产生的热量逐渐破坏玉米黄色素的结构，使玉米黄色素分解，玉米黄色素得率逐渐减小。姚壮和（2013）认为利用微波辅助法来提取色素，应当把微波功率和作用时间两个因素结合，在单因素试验基础上进行提取条件的优化，以确定最佳提取条件。

图7 微波时间对玉米黄色素得率的影响

2.7 优化试验 根据单因素试验结果，设定料液比为 1∶8～1∶4（g/mL），pH 值为 4～6。 由于在微波初期，微波功率为640 W时，微波20 s，玉米黄色素得率最大，微波功率为640 W，微波15、25 s和微波功率为480 W，微波25 s，玉米黄色素得率差异不显著（P>0.05），因此选择微波功率大且时间短的微波条件，当时间相同时，选择微波功率较小的微波条件，以减少玉米黄色素的损失。因此选择微波条件分别为640 W、15 s，640 W、20 s和480 W、25 s。试验因素和水平见表1；试验安排及结果见表2；回归模型的方差分析见表3。

表1 Box-Behnken响应面设计试验因素与水平

表2 响应面试验设计及结果

表3 回归模型的方差分析

经分析得到的得率Y对料液比、pH值和微波条件的二次多元回归方程如下：

Y=0.26-0.003021A+0.001399B+0.002965C-0.004588AB-0.001007AC+0.0006714BC-0.049A2-0.038B2-0.039C2。

表3的方差分析结果表明，方程复相关系数的平方 R2=0.9981，模型极显著（P＜0.01），失拟项不显著（P＞0.05）。 R2adj为0.9956，表明建立的模型能解释99.56%响应值的变化，能很好地描述玉米蛋白粉中的玉米黄色素的得率随提取条件的变化规律。因此该模型可用于预测响应值。

此外，由表3还可以看出，因素A、B、C对玉米黄色素的得率的影响极显著（P＜0.01）。

响应面图及等高线图见图8～10，各因素及其交互作用对响应值的影响结果可通过该组图直观反映出来。等高线的形状反映了交互作用的强弱，椭圆表示两两交互作用显著，圆形则表示交互作用不显著。

图8 料液比（A）与pH（B）响应面图和等高线

图9 料液比（A）与微波条件（C）响应面图和等高线

由图8可以看出，料液比和pH的交互作用显著，随着料液比和pH的增加，得率逐渐增加，但是料液比和pH过高，得率下降，因此料液比为1∶6左右，pH为5左右，得率最大。

由图9可以看出，料液比和微波条件的交互作用不显著，随着料液比的增加，微波条件的改变，得率逐渐增加，但是料液比过高，微波功率减小微波时间增加，得率下降，因此料液比为1∶6左右，微波条件为640 W、20 s左右，得率最大。

由图10可以看出，pH和微波条件的交互作用影响不显著，随着pH的增加，微波条件的改变，得率逐渐增加，但是pH过高，微波功率减小微波时间增加，得率下降，因此pH为5左右，微波条件为640 W、20 s左右，得率最大。

2.8 验证试验 通过优化分析得到的最佳提取条件料液比为1∶6，pH值为5，微波功率640 W，微波时间20 s。进行验证试验，得到玉米黄色素的得率为0.2650 mg/g，与预测值接近。

3 结论

通过响应面建立了料液比、pH值以及微波条件三因素的回归模型，根据响应面优化结果，得到最优的工艺参数为料液比 1∶6，pH值 5，微波功率640 W，微波时间20 s，玉米黄色素的得率为0.2650 mg/g。建立的回归模型方程能够很好地反映玉米黄色素的提取条件与玉米黄色素得率的关系，同时确立了提取玉米黄色素的最优条件。本文研究结果可以为玉米黄色素的工业化提取提供参考依据。

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