日粮高碘对獭兔生长轴相关激素基因mRNA表达的影响

秦 枫， 潘孝青， 邵 乐， 李 晟， 李 健， 杨 杰

（江苏农业科学院畜牧研究所，江苏南京210014）

碘是动物体内不可缺少的微量元素，调节甲状腺激素的合成与代谢。甲状腺激素可以通过参与机体营养物质的代谢，影响动物的生长发育、繁殖以及机体健康等。甲状腺激素是内分泌轴的重要激素，对下丘脑-垂体-生长激素轴有重要的影响。据报道，甲状腺激素在垂体GH合成与分泌中起着关键的作用(Valcavi等，1992)。然而碘摄取过量将导致甲状腺炎、甲状腺肿大、甲减/甲亢等疾病的发生，此外还影响脑发育（Guo等，2006；Yang等，2006）。本试验拟以獭兔为试验动物，探讨日粮中不同水平的碘对獭兔内分泌生长轴基因mRNA的影响，为獭兔碘的安全补饲提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物和饲养管理 选择120只体况良好、体重为（2235.4±13.04）g、4 月龄獭兔作为试验动物，试验前统一驱虫。试验在江苏省农业科学院六合试验兔场进行。试验前对兔舍兔笼进行彻底清扫、消毒。试验獭兔2只为一笼，分别在早上08∶30和下午15∶30饲喂两次，试验獭兔饲喂基础料，饲料为2～3 cm颗粒料，自由饮水，每天清扫卫生，并做好各种记录。预试期内进行分组。

1.2 试验设计 采用单因素完全随机试验设计，将120只獭兔随机分为4组，碘添加水平分别为0、0.2、2、4 mg/kg 干物质（对照组、低水平组、中水平组、高水平组）。试验时间为2012年10—12月，预试期7 d，正式期28 d。

1.3 试验日粮 试验日粮配制参照NRC（1977）兔饲养标准（NRC，1977），代谢能供给量为1.2倍的维持需要。碘以碘酸钾的形式在日粮中添加。基础日粮组成及营养水平见表1。

表1 日粮组成和营养水平（干物质基础）

1.4 样品采集 在试验结束时，每组各随机抽取体重相近獭兔5只，空腹24 h后进行屠宰，采集垂体、肝脏组织，液氮保存。

1.5 实时荧光定量PCR测定垂体GH、肝脏IGF-1和IGFBP1 mRNA

1.5.1 总RNA提取 用Trizol法抽提垂体、肝脏样品中的总RNA，样品中RNA浓度用紫外分光光度计（260 nm）测定。RNA样品经2.0%变性琼脂糖凝胶电泳，EB染色后观察分析，无拖尾现象和其他杂带，则认为RNA样品质量可靠。

1.5.2 RT反应 采用10 μL反应体系，在0.2 mL Eppendorf管中依次加入模板RNA1.0μL，50μmol/L Oligo dT 0.5 μL，100 μmol/L 随机引物 0.5 μl，5×PrimerScript Buffer 2 μL，PrimerScript RT Enzyme Mix I 0.5 μL，RNase free H2O 5.5 μL。 在ABI 9700型PCR仪上37℃保温15 min使逆转录反应完全后，85℃、5 s终止反应。 产物加入 90 μL RNase free H2O稀释至 100 μL，储存在-20℃冰箱，用于后续试验。

1.5.3 荧光定量PCR分析 引物序列及扩增条件见表 2。 20 μL PCR 反应体系：10 μmol/L Forward primer 0.4 μL，10 μmd/L Forward primer 0.4 μL，2×SuperRealPreMix（SYBR Green）10 μL，RNase free H2O 8.2 μL，RT 产物 1 μL。

表2 基因引物序列及扩增片段

1.5.4 基因相对表达量计算方法 以看家基因（GAPDH）作为内参基因，以垂体、肝脏组织cDNA作为模板， 进行 GAPDH、GH、IGF-1、IGFBP1 基因实时荧光定量PCR检测，用得出的CT值制作扩增效率曲线。 试验采用比较 Ct法（2－△△Ct）进行GH、IGF-1、IGFBP1基因mRNA相对表达量的统计分析。试验以GAPDH作为持家基因，从而校正不同样品初始模板量的差异，每个样品重复三次，从而获得平均 Ct值，采用 2－△△Ct法计算样品间 GH、IGF-1、IGFBP1基因mRNA的相对表达量。 2－△△Ct法采用的公式如下：

△△Ct=[Ct（目的基因，试验样品）-Ct（GAPDH，试验样品）]-[Ct（目的基因，参照样品）-Ct（GAPDH，参照样品）]。

每个样品的 2－△△Ct值即是该样品 GH、IGF-1、IGFBP1基因mRNA的相对表达量。

1.6 数据分析 运用Excel整理数据，采用SPSS 17.0中单因素ANVOA统计分析，Duncan’s法进行多重比较，P＜0.05为显著差异。

2 结果与讨论

试验结果见图1、2、3。结果显示，与对照组相比，中水平组、高水平组垂体 GH、肝脏IGF-1基因mRNA表达略有下降，GH表达分别下降3.8%、8.6%，IGF-1表达分别下降 25.8%、19.6%，但均无统计学差异（P>0.05）。此外，肝脏IGFBP1基因mRNA表达高水平组比对照组高14.2%，但也无显著影响（P＞0.05）。

图1 日粮碘对獭兔垂体GH基因mRNA表达的影响

图2 日粮碘对獭兔肝脏IGF-1基因mRNA表达的影响

图3 日粮碘对獭兔肝脏IGFBP1基因mRNA表达的影响

碘是甲状腺激素的重要组成成分，其作用主要通过甲状腺激素体现的。相关研究报道，碘缺乏和碘过量会影响动物体内与甲状腺激素相关基因的表达（张瑞等，2009；王琨等，2008）。本试验主要研究了过量碘对獭兔生长轴相关激素基因表达的影响。甲状腺激素、生长激素和IGF-1是调节动物生长和发育的重要内分泌激素。GH通过IGF-1的介导而起生长调节作用。肝脏是产生IGF-1的最主要器官。IGF-1的作用主要通过受体IGF-1R介导，它具有酪氨酸激酶活性，并通过PI3K/AKP信号通路传递作用。甲状腺激素影响生长是通过改变GH的分泌及影响，作用强弱是通过GH调控IGF-1的合成与分泌实现的 （Wolf等，1989）。GH/IGF-1轴不仅影响动物的生长和其甲状腺功能，而且还影响甲状腺激素的代谢 （Torre等，2000；Jørgensen 等，1999）。

本试验中，发现短期内日粮添加高碘对GH/IGF-1生长轴激素基因mRNA表达没有显著影响。分析原因为：一方面是试验獭兔为青年兔，高碘的添加量可能还不到獭兔最大耐受量；另一方面是短期内碘的作用还可能受到Wolff-Chaikoff法则的影响。但也有研究报道，甲状腺激素可以上调大鼠海马组织中GH及其受体的表达，并促进GH信号转导、促进NSCs和前体细胞向神经元分化，在脑的发育期，这种上调作用呈现在转录和翻译两个水平，进入幼年期之后这种促进作用仅仅表现在翻译水平上，提示甲状腺激素促进脑的生长发育功能可能是通过GH介导而实现的 （汤慧芹，2010）。在外周甲状腺激素对维持血清GH的浓度起着重要的调节作用 （Davis和Tremont，2007；Silva等，2006）。正常血浓度的甲状腺激素能增加垂体细胞GH基础分泌、甲状腺激素缺乏可导致垂体GH储备降低，其机制可能是甲状腺激素与垂体细胞核内的甲状腺激素受体结合后，作用于GH基因启动子5'上游区域的正性甲状腺激素应答元件，从转录水平调控GH基因的表达（Sugawara等，1994）。新近的研究还显示，甲状腺激素可以诱导多聚腺苷酸（polyA）的合成来保护GHmRNA免受核糖核酸酶的降解，从而提高GHmRNA的稳定性（Silva等，2006）。除调控GH基因表达外，甲状腺激素还可促进垂体细胞对促生长激素释放激素的反应，进而促进GH的合成与分泌 （Jones等，1990）。这些现象提示，GH功能的正常发挥，在很大程度上依赖于甲状腺激素。GH也可直接或间接调节外围T4的代谢，通过GH诱导外围T4脱碘转变成 T3（Jorgensen 等，1989）。

3 结论

综上所述，试验期内，高碘日粮对獭兔内分泌生长轴相关激素及蛋白表达无显著影响，由此可见，短期内饲喂高碘日粮不会引起獭兔内分泌轴变化，不会影响其健康与生长，但相关研究还需要进一步深入，以确定獭兔碘供给安全上限。

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