血管紧张素原基因多态性与中国部分少数民族原发性高血压的相关性*

牛淑冬，卓玛次仁，张彬，崔超英，格桑罗布，边巴，朱鹏程，张明涛，佟伟军，孙玉晶，岑维浚，李静平，邱长春

[1.齐齐哈尔医学院基础医学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006；2.西藏自治区人民医院心内科，西藏 拉萨 850000；3.中国医学科学院基础医学院（医学分子生物学国家重点实验室），北京 100005；4.西藏大学医学院高原医学研究中心，西藏 拉萨 850000；5.新疆医科大学第四附属医院心内科，新疆 乌鲁木齐 830054；6.新疆阿勒泰地区人民医院心内科，新疆 阿勒泰 836500；7.内蒙古通辽卫生防疫站，内蒙古 通辽 028000]

·临床论著·

血管紧张素原基因多态性与中国部分少数民族原发性高血压的相关性*

牛淑冬1，卓玛次仁2，张彬3，崔超英4，格桑罗布2，边巴4，朱鹏程5，张明涛6，佟伟军7，孙玉晶3，岑维浚2，李静平1，邱长春1

[1.齐齐哈尔医学院基础医学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006；2.西藏自治区人民医院心内科，西藏 拉萨 850000；3.中国医学科学院基础医学院（医学分子生物学国家重点实验室），北京 100005；4.西藏大学医学院高原医学研究中心，西藏 拉萨 850000；5.新疆医科大学第四附属医院心内科，新疆 乌鲁木齐 830054；6.新疆阿勒泰地区人民医院心内科，新疆 阿勒泰 836500；7.内蒙古通辽卫生防疫站，内蒙古 通辽 028000]

目的研究血管紧张素原（AGT）基因多态性位点M235T、A-6G、A-20C及其单倍型（M235T-A-6GA-20C）与中国部分原发性高血压（EH）高发的少数民族（蒙古族、哈萨克族、藏族）EH易感性的关系，比较AGT对不同民族人群EH发病风险的影响。方法应用聚合酶链反应（PCR）及限制性片段长度多态性（RFLP）技术判定基因型，采用Haploview软件进行单倍型分布分析。结果哈萨克族EH组-6G分布显著高于对照组（42.34%vs 36.98%，P=0.009）。藏族EH组20C分布显著低于对照组（18.17%vs23.19%，P=0.038）。哈萨克族EH组M-A-A的分布频率显著低于对照组（38.16%vs 47.50%，P=0.001），而EH组M-G-A分布频率显著高于对照组（16.20%vs 8.61%，P=0.000）。藏族EH组T-A-A分布频率显著高于对照组（71.89%vs 64.15%，P=0.006）。结论AGT多态性与EH的相关性具有显著的种族异质性，M235T、A-6G、A-20C与中国蒙古族EH发病风险无关，-6G与哈萨克族EH易感性升高相关，而20A可能降低藏族EH的发病风险；单倍型M-G-A和T-A-A可能分别与哈萨克族和藏族EH易感性升高相关，而M-A-A可能是哈萨克族抗EH的保护性因素。

原发性高血压；血管紧张素原基因；基因多态性；单倍型；中国少数民族

流行病学调查显示，原发性高血压（essential hypertension，EH）在中国各民族的发病率差异较大，生活在高原地区或北方的藏族、哈萨克族和蒙古族等患病率较高，生活在南方或非高原地区的苗族、壮族等患病率则较低[1]。2002年统计结果表明，藏族EH患病率（24.7%）为中国各民族之首，哈萨克族为18.97%，蒙古族为17.6%。患病率的差异表明各民族人群的EH易患性、易感性不同，因此对不同民族人群开展EH的分子遗传学研究，对加强EH预防、探索EH个体化诊断与治疗具有重要意义。

血管紧张素原（angiotensinogen，AGT）是肾素-血管紧张素-醛固酮系统（renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS）的初始底物，在肾素的作用下水解为血管紧张素Ⅰ，后者在其他酶的作用下转变为血管紧张素Ⅱ、Ⅲ，影响水、盐代谢及血管阻力，进而影响血压[2]。AGT基因位于染色体1q42、43区，全长1 030 bp。由5个外显子和4个内含子组成，是最早发现，也是目前为止研究最多的EH候选基因。大量研究表明AGT单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNPs）与EH有关，但研究结果并不一致[3]，中国各地区、各民族的研究结果也各不相同，提示AGT多态性与EH的相关性具有显著的种族异质性[4-5]。

本文总结课题组多年来以人群为基础的病例-对照研究结果，分别探讨A-6G、A-20C、M235T 3个多态性位点的等位基因、基因型、单倍型分布频率与蒙古族、哈萨克族及藏族EH相关性，旨在比较分析AGT基因在中国部分EH高发的民族、地区对EH发病风险的影响。

1 资料与方法

1.1 仪器与试剂

引物购自宝生物工程（大连）有限公司，Taq聚合酶购自北京全式金生物技术有限公司，限制性内切酶购自宝生物工程（大连）有限公司，Mycycler Thermal Cycler扩增仪购自伯乐生命医学产品（上海）有限公司，直接测序委托北京华大中生科技发展有限公司完成。

1.2 研究对象

研究对象为≥3代居住于所在地区的长期稳定居民，与其他民族无通婚史。EH患者入选标准采用《1999年WHO/ISN高血压治疗指南》：①收缩压（systolic pressure，SBP）≥140 mmHg和/或舒张压（diastolic pressure，DBP）≥90 mmHg；②20～60岁发病；③排除继发性高血压、糖尿病、肾病等慢性疾病；④未进行抗高血压药物治疗。按性别、年龄、职业匹配选择正常对照人群，年龄＞40岁，SBP≤130 mmHg和DBP≤80 mmHg。该项研究获得齐齐哈尔医学院医学伦理委员会批准，所有参加调查对象签署知情同意书。

各民族研究对象及所在地区如下：①蒙古族：EH组243例，对照组258例，全部来自内蒙古自治区；②哈萨克族：EH组521例，对照组623例，全部来自新疆阿勒泰地区；③藏族：EH组333例，对照组235例，全部来自西藏自治区拉萨市。

1.3 实验方法

1.3.1 基因组制备采集外周静脉血5 ml，采用低渗法破除红细胞，酚-氯仿抽提法抽提、纯化。DNA纯度达A260∶A280≥1.80。

1.3.2 基因分型采用聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）及限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）技术判断基因型，并随机选取10%的样本直接测序，验证PCR-RFLP分型的准确性。

PCR扩增反应引物序列：A-20C（rs5050）和A-6G（rs5051），正向引物：AGAAATCCCAGCGTGAGTGT，反向引物：AGAC CAGAAGGAGCTGAGGG；M235T（rs699），正向引物：CAGGGTGGTCCACACTGGACCCC，反向引物：CGTTTGTGCAGGGCCTGGCTCTCT。PCR扩增反应体积为25μl，反应体系内含10×PCR缓冲液，200μmol/L dNTPs，10 pmol引物，50 ng模板DNA，Taq聚合酶1 u。PCR扩增反应条件如下：94℃预变性5 min，94℃变性45 s，59℃退火45 s，72℃延伸60 s，共30个循环，72℃继续延伸5 min。各取每种PCR产物5μl，分别采用内切酶Eco109Ⅰ、BstNI、TthⅢ，按推荐条件进行限制性酶切反应，以鉴定A-20C、A-6G、M235T基因型。酶切产物以2%琼脂糖凝胶电泳分离，紫外灯下观察鉴定。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，等位基因和基因型频率估算用直接基因计数法，组间比较用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 蒙古族、哈萨克族、藏族人群AGT基因型与等位基因频率分布

蒙古族人群中，M235T、A-6G、A-20C在EH组和对照组的基因型及等位基因分布频率比较，差异无统计学意义。哈萨克族人群中，A-6G在EH组和对照组的基因型分布频率比较，差异有统计学意义（P= 0.010），且-6G在EH组的分布频率显著高于对照组（P=0.009）。藏族人群中，EH组-20C分布频率显著低于对照组（P=0.038）。见表1。

表1 蒙古族、哈萨克族、藏族人群AGT基因型/等位基因频率分布

2.2 蒙古族、哈萨克族、藏族人群AGT基因的M235T-A-6G-A-20C单倍型分布频率

蒙古人群中有6种分布频率＞1%的单倍型，各单倍型在EH组和对照组比较差异均无统计学意义。哈萨克族人群中有6种分布频率＞1%的单倍型，其中M-A-A在EH组的分布频率显著低于对照组（P=0.001），而M-G-A在EH组分布频率显著高于对照组（P=0.000）。藏族人群中有8种分布频率＞1%的单倍型，其中T-A-A在EH组分布频率显著高于对照组（P=0.006），而M-G-A和T-A-C分布频率显著低于对照组（P＜0.05）；但经严格的Bonferroni校正后，M-G-A和T-A-C在藏族EH组和对照组的分布频率比较，差异无统计学意义。见表2。

续表1

表2 蒙古族、哈萨克族、藏族人群AGT基因M235T-A-6G-A-20C单倍型分布频率%

3 讨论

AGT基因中，位于第2外显子的M235T是外显子中最重要的多态性位点之一。据文献报道，M235T与白种人、日本人EH相关[3]，与血浆AGT水平相关，235TT纯合子较235MM纯合子EH易感性升高11%[6]。但本研究中，M235T与中国藏族、哈萨克族、蒙古族EH易感性无明显相关。该结果与孔祥东等[5]的研究结果一致，但与WANG等[4]的研究结果不符。由于M235T不是AGT蛋白的酶切位点，不会影响AngⅡ的生成；同时M235T并不影响AGT基因的转录和翻译，因此有研究者认为，M235T可能是附近与EH有关的突变的遗传标记，M235T多态性与EH的关联是通过血管紧张素原基因核心启动子（angiotensinogen core promoter element 1，AGCE1）序列介导的。AGCE1位于TATA盒和转录起始位点之间，可结合一种广泛表达的转录因子AGT核心启动子结合因子1（human AGT gene core promoter element binding factor 1，AGCF1），对AGT转录起始及基因表达方式产生重要影响[7]。该区域的A-6G、A-20C与M235T位点完全连锁不平衡[8]，其中A-6G直接影响AGT基因基础转录速率，A-20C变异影响人体血浆中AGT和血管紧张素Ⅱ的水平，上述变异均与EH显著相关。

在中国各民族人群中，A-6G、A-20C多态性与EH的关联具有明显的民族差异性[5，9]。本研究中，A-20C与蒙古族、哈萨克EH组无明显相关，该结果与孔祥东等[5]的研究结果一致，但在藏族人群中，EH组-20C分布频率显著低于对照组，提示C等位基因可能是藏族人群EH的抗性因素。目前，关于A-6G的报道尚无一致结果，李南方等[10]报道-6G变异与哈萨克族EH有关；LIU等[9]报道，A-6G与汉族和彝族的EH无关联；本研究结果显示，-6G与哈萨克族EH显著相关，可能是哈萨克EH的风险因子。上述研究结果的矛盾可能由多种因素造成。首先，AGT合成受多种因素调控，如AGT基因5'-端非编码区的雌激素、糖皮质激素、甲状腺素和应激反应调控元件，启动子附近区域的AGE2和AGE3顺式作用元件等[11]，扩大研究位点的范围可能更有助于揭示不同种族、不同民族AGT基因多态性在EH发病中的作用。此外，由于性别的分层原因导致的假关联、上位效应也是不易排除的因素。

对于蒙古、哈萨克、藏族AGT基因单倍型的研究结果显示，含有A-20C-A-6G-M235T多态性位点的单倍型与蒙古族EH无关；携带M-G-A的哈萨克族和携带T-A-A的藏族人群患EH风险显著升高，提示上述两种单倍型可能是哈萨克族和藏族人群的EH风险因子；而M-A-A在哈萨克族EH组中的分布频率显著低于对照组，表明该单倍型可能是哈萨克族人群的保护性因素。单倍型M-A-A与M-G-A比较，其差异仅在A-6G位点不同，说明A-6G位点在A-20C-A-6G-M235T单倍型中起很强作用。该结果与哈萨克族单个基因分析的结果相互支持，提示作为AGT基因核心启动子区的多态性位点，A-6G是哈萨克族人群EH的一个重要影响因子。

本研究表明，同一多态性位点对不同民族EH发病的影响不同，进一步提示EH病因学的遗传异质性和揭示不同民族EH遗传学基础的必要性。本项研究的优势在于参与者均生活于环境较为封闭、人群流动性小的地区，遗传背景单纯，可有效代表所研究人群的遗传特性，提高研究结果的准确性和和可信度。不足在于样本量偏小，研究的位点有限，未能测定AGT的血浆浓度。需要扩大样本量及研究位点的范围以进一步明确AGT基因多态性对于中国各民族EH发病的影响。

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（申海菊 编辑）

Association between angiotensinogen gene polymorphisms and essential hypertension in a part of Chinese minorities*

Shu-dong NIU1,Ci-ren ZHUO-MA2,Bin ZHANG3,Chao-ying CUI4,Luo-bu GE-SANG2, Ba BIAN4,Peng-cheng ZHU5,Ming-tao ZHANG6,Wei-jun TONG7,Yu-jing SUN3, Wei-jun CEN2,Jing-ping LI1,Chang-chun QIU1
[1.College of Basic Medical Sciences,Qiqihar Medical University,Qiqihar,Heilongjiang 161006,P.R.China;2.Department of Cardiology,the People's Hospital of Tibet Autonomous Region,Lhasa,Tibet Autonomous Region 850000,P.R.China;3.Institute of Basic Medical Sciences(National Laboratory of Medical Molecular Biology),Chinese Academy of Medical Sciences,Beijing 100005,P.R.China;4.Institute of High Altitude Sickness,Medical College, Tibet University,Lhasa,Tibet Autonomous Region 850000,P.R.China;5.Department of Cardiology,the Fourth Affiliated Hospital,Xinjiang Medical University,Urumuqi,Xinjiang Uyghur Autonomous Region 830054,P.R.China;6.Department of Cardiology,Altay RegionPeople's Hospital,Aletai,Xinjiang Uyghur Autonomous Region 836500,P.R.China; 7.Tongliao Sanitation and Antiepidemic Station,Tongliao,Inner Mongolia Autonomous Region 028000,P.R.China]

【Objective】To study the association between angiotensinogen gene(AGT)polymorphic site M235T,A-6G,A-20C and the haplotype(M235T-A-6G-A-20C)and the susceptibility to essential hypertension(EH)in a part of high-risk minorities in China including Mongolian,Kazakh and Tibetan,and to compare the effect of AGT gene variations on EH in different minorities.【Methods】The polymorphisms were genotyped by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP),the haplotype distribution was analyzed by Haploview software.【Results】In single locus study,the distribution of-6G was significantly higher in the EH subjects than in the normal subjects(42.34%vs 36.98%,P=0.009)in Kazakhs；the distribution of-20C was significantly lower in the EH subjects than in the normal subjects (18.17%vs 23.19%,P=0.038)in Tibetans.In haplotype analysis,the distribution of M-A-A was significantly lower in the EH subjects than in the normal subjects(38.16%vs 47.50%,P=0.001)in Kazakhs,while the distributions of M-G-A and T-A-A were significantly higher in the EH subjects than in the normal subjects in Kazakhs and Tibetans,respectively(M-G-A:16.20%vs 8.61%,P=0.000；T-A-A:71.89%vs 64.15%,P= 0.006).【Conclusions】The correlation between AGT polymorphisms and EH has showed significant ethnic heterogeneity.M235T,A-6G and A-20C are not associated with the susceptibility to EH in Mongolian population.-6G is associated with the increased risk of EH in Kazakhs；-20C may decrease the risk of EH in Tibetans.Haplotype M-G-A and T-A-A may increase the genetic susceptibility to EH in Kazakhs and Tibetans,respectively,and M-A-A may be a protective haplotype for Kazakhs.

essentialhypertension；angiotensinogengene；genepolymorphism；haplotype；Chinese minority

R394；R34

A

1005-8982（2015）29-0044-05

2015-03-09

国家自然科学基金（No：31171146；31371208；30393132）；国家重点基础研究发展计划项目（973计划）（No：2006BAII9B07）

邱长春，E-mail：changchun_qiu@163.com；Tel：0452-2663389