乙肝病毒S蛋白诱导人精子凋亡的分子机制

康祥锦，丁 悦，杨 洁，杜红姿，刘见桥，黄天华*

（1. 广 州医科大学附属第三医院生殖医学中心，广东省生殖医学重点实验室，广东省产科重大疾病重点实验室，广东省普通高校生殖与遗传重点实验室，广东 广州 510150；2. 汕 头大学医学院生殖医学研究中心，广东 汕头 515041）

乙肝病毒S蛋白诱导人精子凋亡的分子机制

康祥锦1，丁 悦1，杨 洁1，杜红姿1，刘见桥1，黄天华2，*

（1. 广 州医科大学附属第三医院生殖医学中心，广东省生殖医学重点实验室，广东省产科重大疾病重点实验室，广东省普通高校生殖与遗传重点实验室，广东 广州 510150；2. 汕 头大学医学院生殖医学研究中心，广东 汕头 515041）

乙肝病毒（ hepatitis B virus，HBV）感染给人类健康和生命带来严重威胁。乙肝病毒表面S蛋白（HBV S protein，HBs）作为HBV的亚病毒颗粒主要组成部分，其数量远远多于HBV颗粒。在慢性乙肝患者体内HBV能够自我组装成大量分泌性的亚病毒颗粒，总浓度可达50～300 mg/mL［1］。2008年，Zhou等［2］将人精子与HBs蛋白体外共孵育，发现HBs能够引起精子线粒体膜电位、精子活力、受精能力显著下降，并导致精子大量死亡。Moretti等［3］发现乙肝患者精子的活力比正常人精子活力降低且有较高比例的凋亡和坏死。但其中涉及的具体机制仍未阐明。

细胞凋亡是细胞为维持内环境稳定，细胞自主的、有序的死亡。生精细胞的凋亡可以维持精子发生过程的动态平衡，以维持成熟精子的质量和数量。精子凋亡与男性不育关系密切。精子过度凋亡可能是引起特发性少精、弱精、畸形精子症的原因［4-5］。人类射出的精子中也存在凋亡现象并显示了一些凋亡特征的改变，如活性氧升高、磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine， PS）外翻、线粒体膜电位降低、Caspases的激活和DNA片段形成等［6-8］。本研究拟通过探讨HBs诱导人精子凋亡的分子机制，以揭示HBV感染引起男性患者生育力下降的原因，为进一步研究提高男性生育力的措施提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

HBs购自华北制药金坦生物技术有限公司（纯度＞99%）。BWW培养基各成分（分析纯）和牛血清白蛋白均购自Sigma公司；Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒，Caspase-3、-8、-9检测试剂盒，FragELTMDNA片段检测试剂盒均购自德国MERCK公司。

1.2 精子样本处理

采用健康志愿者提供的精液标本（HIV、HBV和HCV检测均为阴性） 。精液样本于无菌烧杯中在培养箱（ 37 ℃，CO2体积分数为5%） 中液化30 min。液化后的精液分装于5 mL玻璃试管中，每管约1 mL，缓缓加入2 mL BWW培养基（含0.3%牛血清白蛋白），在37 ℃，CO2培养箱中待精子上游1.5 h后取上清300 g离心5min。弃上清，BWW培养基洗涤2次后，用BWW培养基调节精子浓度为1×106/mL后备用。

1.3 精子与HBs共孵育

将0.5 mL精子样本（1×106/mL）分别与不同终浓度的HBs蛋白（0、25、50、100 μg/mL）在CO2培养箱（37℃，CO2体积分数为5%）中共孵育3 h后，检测HBs对人精子凋亡各项指标的剂量效应。

1.4 Annexin V-FITC/PI双染法检测精子磷脂酰丝氨酸外翻

在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸位于细胞膜内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，Annexin-V与PS的结合成为凋亡早期的一种重要检测标志事件。本研究采用异硫氰酸荧光素标记的Annexin V结合流式细胞术对精子PS外翻情况进行检测。取1×106/mL的精子悬液0.5 mL，分为4组，分别为与0、25、50、100 μg/mL HBs孵育3 h组。将各处理组精子室温1 000 g离心5 min，弃上清；用0.5 mL预冷的PBS溶液重悬精子；室温1 000 g离心5 min，弃上清液；再用0.5 mL预冷的1×结合缓冲液（Annexin VFITC/PS凋亡检测试剂盒）轻摇重悬精子；加入1.25 μL Annexin V-FITC；室温（18～24 ℃）避光反应15 min后，室温1 000 g离心5 min，弃上清；加入10 μL 碘化丙啶（PI）；将样本置于冰上避光保存并用流式细胞仪在波长488 nm处检测。

1.5 精子内Caspase-3、-8、-9激活的检测

Caspase的活化是凋亡的典型特征。本实验采用FITC标记的抑制剂检测HBs蛋白对人精子内Caspase活化的影响。取1×106/mL的精子悬液0.5 mL，分别与0、25、50、100 μg/mL HBs孵育3 h，并设置HBs+1μL/mL Caspase抑制剂Z-VAD-FMK共孵育的人精子对照组。将各处理组精子1 000 g离心5 min，弃上清液，轻轻混匀；实验组精子分别加入1 μL FITC-DEVDFMK、FITC-IETD-FMK、FITC-LEHD-FMK（依次检测Caspase-3、-8、-9）至各处理组，在CO2培养箱内孵育1h；将精子沉淀离心洗涤2次；后用300 μL洗涤缓冲液重悬精子，并置于冰上；上流式细胞仪检测。

1.6 精子内DNA损伤的检测

在凋亡晚期细胞中，DNA被降解为不同大小的片段，本研究将FITC标记和未标记的dNTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶的作用下，连接到凋亡细胞中断裂DNA片段的3´-OH末端，流式细胞仪检测HBs蛋白对人精子DNA损伤的影响。取1×106/mL的精子悬液0.5mL，分别与0、25、50、100 μg/mL HBs孵育3 h，每组5个样本。将各处理组精子4 ℃、1 000 g离心5 min后，于4%的甲醛溶液中室温固定10m in；4℃ 、1000g 离 心5 min，去除固定液；用80% 乙醇溶液以相同细胞密度重悬；室温1 000 g 离心 5 min，弃上清液；用200 μL TBS溶液重悬精子；室温 1 000g 离心5m in，去除TBS溶液；将精子重悬于100μ L 20μ g/mL的蛋白酶K溶液中，室温孵育5 min；室温1 000 g离心5 min，去除蛋白酶K溶液；用100 μL 1×TdT 缓冲液重悬精子，室温孵育10～30 min后，室温1 000 g 离心5 min，去除平衡缓冲液；将细胞重悬在60 μL标记反应混合物溶液（Biotin-FragELTMLabeling Reaction Mix、3 μL TdT酶），阴性对照的标记反应混合物中加入同体积蒸馏水；37 ℃ 避光孵育 1～1.5 h；室温1 000 g离心5 min，去除标记反应混合物；将细胞重悬于200 μL TBS 溶液中。重复清洗后将细胞重悬于0.5m L T BS溶液中；上流式细胞仪检测。

1.7 流式细胞术分析

所有标记精子的荧光信号均通过流式细胞仪进行检测。每份样本至少检测10 000个精子，细胞流速为每秒50～500个细胞。激发波长为488 nm。应用Cell Quest与Win MDI 2.9软件分析阳性精子的比率和平均荧光强度。

1.8 统计学处理

2 结 果

2.1 HBs诱导人精子膜磷脂酰丝氨酸外翻

见图1。根据正常对照组及实验组FITC及PI荧光作双参数点图，将细胞分为4个区：左上区，机械损伤细胞（Annexin V-FITC-/PI+）；右上区，凋亡晚期或坏死细胞（Annexin V-FITC+/PI+）；左下区，活细胞（Annexin V-FITC-/PI-）；右下区，早期凋亡细胞（Annexin V- FITC+/PI-）。25、50、100 μg/mL HBs 处理人精子3 h后，实验组（图1B）的Annexin V- FITC+/PI-精子比例显著高于对照组（图1A）（P＜0.01）。此结果表明，人精子与HBs蛋白共孵育后可通过引起精子膜磷酯酰丝氨酸外翻导致精子胞膜功能异常。此外，人精子经不同浓度HBs（0、25、50、100 μg/mL）处理3 h后，磷脂酰丝氨酸的外翻即Annexin V- FITC+/PI-的精子比率分别为1.39%±0.77%、5.95%±1.33%、15.55%±6.15%、28.55% ±13.98%，HBs对人精子胞膜磷脂酰丝氨酸外翻的影响呈剂量依赖趋势（表1）。

2.2 HBs诱导人精子内Caspase-3、-8、-9的活化

HBs蛋白对人精子内Caspase-3、-8、-9活化的影响如图2所示：25 µg/mL HBs处理组Caspase-3、-8、-9 阳性精子的比率分别为53.01%、45.34%、59.31%（图2D～F），而对照组分别为40.59%、28.10%、36.29% （图2A～C）。结果显示，25 µ g/mL H Bs处理组的Caspase-3、-8、-9阳性比率均显著高于对照组（P＜0.05）。此结果表明，HBs可以诱导人精子内Caspase-3、-8、-9的活化。人精子经不同浓度HBs（0、25、50、100 μg/mL）处理3h后，Caspase-3、-8、-9阳性精子比率均较对照组明显升高（P＜0.05或P＜0.01），表明人精子经不同浓度HBs处理后Caspase-3、-8、-9的激活与HBs呈剂量依赖趋势（表1）。

2.3 HBs对人精子DNA损伤的影响

图3和表1显示了HBs蛋白对人精子DNA损伤的影响，人精子与25µg/mL HBs共孵育3 h后，TUNEL阳性精子比率显著高于对照组（P＜0.01）。人精子经不同浓度HBs（0、25、50、100 μg/mL）处理3 h后，精子内DNA损伤水平与HBs呈剂量依赖效应的趋势（表1）。

3 讨 论

细胞凋亡在众多病理和生理过程中发挥重要作用［9］。男性生殖细胞的异常凋亡可通过影响精子的质量包括精子存活力、活率、形态异常等缺陷而引起男性不育［10-11］。HBV可通过损伤精子功能导致男性不 育［12］。已证实HBV病人的平均精液浓度、精子活力、活率、形态异常及含有高比例凋亡和坏死精子。HBs 作为HBV的亚病毒颗粒主要组成部分，可导致慢性HBV携带者持续的肝脏炎症和损伤。尽管病毒感染可以影响患者的生育能力，但HBV感染对精子功能影响的分子机制仍鲜有报道。

表1 HBs对人精子凋亡相关指标的影响（±s，%，n=5）

与对照组比较，*P＜0.05；**P＜0.01.

组别A n n e x i n V -F I T C / P I精子+ -C a s p a s e -3阳性精子C a s p a s e -8阳性精子C a s p a s e -9阳性精子T U N E L阳性精子对照组1. 39 ± 0. 7 7 45. 07 ± 10. 48 37 . 18 ± 3. 46 27 . 23± 3. 8 012. 8 1± 3. 8 0H B s 25 μ g / m L 5. 9 5± 1. 33* * 54. 34± 3. 37 * 56 . 7 4± 2. 11* 45. 26 ± 3. 8 4* * 27 . 04± 3. 12* * 50 μ g / m L 15. 55± 6 . 15* * 56 . 49 ± 6 . 27 * 59 . 7 2± 3. 32* 49 . 12± 3. 7 2* * 56 . 29 ± 7 . 15* * 100 μ g / m L 28 . 55± 13. 9 8 * * 6 2. 13± 12. 7 1* * 6 2. 54± 3. 43* 6 4. 7 0± 3. 7 6 * * 6 0. 53± 9 . 7 6 * *

本研究通过Annexin V-FITC/PI双染、Caspases活化、TUNEL等实验探讨HBs是否可导致人精子凋亡。磷脂酰丝氨酸外翻是精子早期凋亡的指征，Annexin V阳性精子的比率与精子参数及精子受精能力呈显著负相关［13］。本研究发现人精子与25 μg/mL HBs共孵育3h后Annexin V-FITC+/PI-精子比率显著升高（P＜0.01），磷脂酰丝氨酸外翻与HBs（0、25、50、100 μg/mL）呈剂量依赖关系。此结果表明HBs能导致人精子胞膜磷脂酰丝氨酸外翻而引起精子早期凋亡。

许多来自细胞外和细胞内的刺激可以启动细胞凋亡，如细胞毒剂暴露、辐射、DNA损伤、氧化应激等。Caspases在细胞凋亡的起始和执行过程中发挥着重要的作用［14］。已证实人精子中存在激活的Caspase-3、-8、-9，且Caspases的激活与低生育力有关［15］。本研究发现人精子与25 µg/mL HBs共孵育后，Caspase-3、-8、-9水平与对照组相比均显著升高（P均＜0.01）， 且Caspase-3、-8、-9的激活与HBs（0、25、50、100 µg/mL）呈剂量依赖性。此结果表明HBs可诱导人精子内Caspase-3、-8、-9激活。DNA断裂为细胞凋亡的晚期事件。本研究发现精子和HBs共孵育3 h后，精子内DNA损伤片段显著高于对照组（P＜0.01）。此结果表明HBs能导致精子DNA损伤，且与HBs（0、25、50、100µg/mL）呈剂量依赖趋势。

Zhou等［2］研究表明，HBs可诱发精子线粒体膜电位丧失，精子线粒体膜电位的丧失使得精子缺乏能量难以维持其活力；Caspase依赖性凋亡和Caspase非依赖性凋亡的转换及DNA损伤可能会启动精子的死亡通道。所有这些事件的最终可影响精子的正常功能，或导致精子的死亡，从而引起精子活力降低或受精能力下降。本研究有力的证明了乙肝病毒HBs蛋白可通过Caspase依赖和Caspase非依赖的途径引起人精子凋亡，为揭示HBs降低人精子受精能力的机制供了直接的实验证据。

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Study of the mechanisms of human sperm apoptosis by hepatitis B virus S protein

KANG Xiangjin1，DING Yue1，YANG Jie1，DU Hongzi1，LIU Jianqiao1，HUANG Tianhua2，*
（1. Center for Reproductive Medicine， Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University， Key Lab for Reproductive Medicine of Guangdong Province， Key Lab for Major Obstetric Diseases of Guangdong Province， Key Lab of Reproduction and Genetics of Guangdong Higher Education Institute， Guangzhou 510150；2. Research Center for Reproductive Medicine， Shantou University Medical College， Shantou 515041， Guangdong， China）

目的： 探讨乙肝病毒S蛋白（HBs）诱导人精子凋亡的分子机制。方法：人精子与不同浓度（0、25、50、100 μg/mL）HBs共孵育3 h后，应用Annexin V-FITC/PI双染法检测HBs对精子早期凋亡指标磷脂酰丝氨酸外翻情况，用流式细胞术检测精子细胞内半胱氨酸蛋白酶-3、-8、-9（Caspase-3、-8、-9）活化，用TUNEL结合流式细胞术检测精子DNA的损伤。结果：人精子与25～100 µg/mL HBs共孵育3 h后，Annexin V-FITC+/PI-精子，Caspase-3、-8、-9阳性精子，TUNEL阳性精子的比率均显著高于对照组（P＜0.05或P＜0.01），且均呈剂量依赖趋势。结论：25～100 µg/mL HBs可诱发人精子胞膜磷脂酰丝氨酸外翻，胞内Caspase-3、-8、-9激活和DNA损伤，从而致使人精子凋亡以影响精子的功能。

HBs；凋亡；胞膜完整性；精子功能

OBJECTIVE:To explore the mechanisms of human sperm apoptosis by hepatitis B virus S protein.METHODS：After the co-incubation of sperms with 0，25，50 and 100 μg/mL HBS for 3 h，the externalization of membrane phosphatidylserine （PS）；Caspase-3，-8，-9 activation and DNA fragmentation of human sperm were assessed.RESULTS：After incubation，the average rates of Annexin V-positive/propidium iodide （PI）-negative sperm，Caspase-3，-8，-9 positive sperm and TUNEL-positive sperm were significantly increased in the test groups as compared to those in the control groups （P＜0.05 or P＜0.01），and in a dose-dependent manner.CONCLUSION：HBs exposure could lead to PS externalization，activation of caspases，and DNA fragmentation，resulting in increased apoptosis of sperms and causing sperm dysfunction.

HBs；apoptosis；membrane with normal integrity；sperm function

Q291

A

1004-616X（2015）01-0044-05

10.3969/j.issn.1004-616x.2015.01.010

2014-11-19；

2014-12-16

国家自然科学基金项目（81401254）；广东省人口和计划生育委员会资助项目（20133064）；广州市荔湾区科技和信息化局资助项目（20131215083）；广州医科大学博士启动资金（2012C52）

作者信息：康祥锦，E-mail：kangxiangjin@163.com。*通信作者，黄天华，E-mail：t hhuang@stu.edu.cn