脱氧雪腐镰刀菌烯醇致小鼠畸形骨骼组织差异表达基因及相关通路分析

李 岩，赵英会，庄东明，李晓霞，于爱莲*

（泰山医学院基础医学院，山东 泰安 271000）

脱氧雪腐镰刀菌烯醇致小鼠畸形骨骼组织差异表达基因及相关通路分析

李 岩，赵英会，庄东明，李晓霞，于爱莲*

（泰山医学院基础医学院，山东 泰安 271000）

脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）是一种主要由禾谷镰刀菌产生的单端孢霉烯族毒素［1］，它是谷类食物中的一种常见污染源。二十世纪初有报道DON与动物骨骼畸形有关，它能引起鸟类软骨发育不全，小鼠的胸肋分节不正常等［2］。Collins等［3］研究结果显示，DON可以引起多个部位的骨化程度下降、胸关节的不合并以及异常等。对于DON引起骨骼畸形的机制研究甚少，仅有Sergeev等［4］进行了初步研究，发现口服DON的小鼠出现体内钙平衡紊乱。本研究采用具有准确性高、数据可靠、高密度和高通量分析特点的NimbleGen 60mer小鼠全基因组12×135k长寡核苷酸基因表达谱芯片，检测小鼠正常骨骼组织和畸形骨骼组织基因表达谱的变化。通过基因本体学（gene o ntology，GO）分析软件，对差异表达基因的生物学功能进行注释或基因分类，筛选出两组之间具有显著性差异的GO条目。通过DAVID database数据库筛选骨骼组织差异表达基因所涉及到的信号传导通路，为阐明DON致骨骼畸形的分子机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

DON毒素，购自Sigma公司；健康性成熟的昆明小鼠，购自山东大学实验中心；Trizol试剂盒，购自Invitrogen公司；Mus musculus 12×135k小鼠全基因组寡核苷酸芯片，购自上海康成生物工程有限公司；NimbleGen 芯片杂交试剂盒，购自Roche公司。

1.2 动物模型的建立与取材

取妊娠母鼠30只，随机分成空白对照组、溶剂对照组、低剂量DON染毒组、中剂量DON染毒组、高剂量DON染毒组共5组，每组各6只，空白对照组不作任何处理。溶剂对照组注射丙二醇和生理盐水配制的溶剂，3个实验组分别按4、6.4和10 mg/kg设置DON浓度梯度，于妊娠第7、8、9、10天连续腹腔注射。母鼠妊娠第18天，颈椎脱臼法处死母鼠，剖腹取出胎鼠并去除皮肤与内脏，保留颅骨及脊柱骨架。

1.3 总RNA的提取

取100 mg新鲜椎体骨骼组织样品，用Trizol法提取总RNA，操作方法按照试剂盒说明书。分光光度仪测定吸光度值D（260）和D（280），计算浓度。

1.4 cDNA基因表达谱芯片

进行cDNA的合成（参照Invitrogen Superscript双链cDNA合成试剂盒），用Nanodrop进行cDNA定量和质控。用NimbleGen单色DNA标记试剂盒Cy3标记已合成好的cDNA标本。然后在标准条件下将标记好的cDNA和cDNA基因表达谱芯片进行杂交（参照NimbleGen芯片杂交试剂盒）。cDNA基因表达谱芯片有44 170个不同的cDNA，以管家基因GAPDH作为内参。杂交信号的荧光强度用GenPix4000B芯片扫描仪进行检测。

将实验结果转换成数字型数据保存，使用GenePix pro V6.0软件读取原始荧光值，并对原始数据进行分析运算。用t检验筛选两组之间比较P＜0.05的基因且倍数变化大于2的为差异表达基因，P值越小，越有理由说明该基因在两样本间表达不同。

1.5 实时荧光定量PCR

选取对照组和实验组中与骨骼发育密切相关的6个差异表达基因，GAPDH作为内参，用qPCR验证芯片结果。总反应体系25 μL，包括dNTP 2.5 μL，cDNA 1 μL，终浓度0.25× SYBR Green 2.5 μL，10 μmol/L正向和反向PCR特异性引物各1 μL，Tap聚合酶1 μL等。反应条件为95 ℃、5 min，然后在95 ℃、10 s变性、59℃、15 s退火，共35个循环，最后72℃ 、20 s延伸。

1.6 差异表达基因的功能分析及通路分析

采用基因本体学（gene ontology，GO）分析软件，对筛选出的差异表达基因的生物学功能进行基因分类，筛选出在两组之间具有显著性差异的GO条目。从生物学过程、分子功能和细胞组分3个方面对基因的功能进行分类。采用Genespring GX软件和DAVID database 数据库对上述筛选到的差异基因所涉及到的信号通路进行检索分析，探讨DON致骨骼畸形的分子机制。

2 结 果

2.1 胎鼠骨骼组织差异表达基因的确定

对正常对照组胎鼠和母鼠DON染毒后所产畸形胎鼠椎体骨骼组织中反转录后产生的cDNA进行基因芯片检测发现，在总共的44 170个基因中，筛选出972个差异表达基因，占总数的2.20%，经DON染毒后有445个基因表达下调，517个基因表达上调；差异倍数大于2倍的基因有282个（P＜0.05），其中上调基因134个，下调基因148个。表达上调的基因中与骨骼发育密切相关的有Pax1、Fbn1、Col9a2、Papss2和Lgals3；表达下调的基因中与骨骼发育密切相关的有Runx2、Pthlh、Hexb、s100a9。表达有显著性差异的基因除了编码与骨骼畸形有关的蛋白、胚胎畸形有关的蛋白（见表1），还包括编码与癌症、血液、炎症、神经系统等有关的蛋白以及未知功能的蛋白。

2.2 实时荧光定量PCR验证结果

在小鼠胚胎骨骼组织差异表达的基因中，随机选取6个基因Pax1、Runx2等做qPCR检测，发现上调基因和下调基因的变化趋势和cDNA微阵列的变化趋势一致，见图1。

2.3 差异表达基因的功能分析结果

通过GO分析发现，对照组和实验组椎体骨骼组织中差异表达的基因，有32.80%与生物过程有关，32.80% 与细胞组分有关，另有35.18%与分子功能有关。三方面中各亚层次所占比例见图2～图4。

2.4 差异表达基因信号传导通路分析结果

经DAVID database数据库分析共涉及信号传导通路153个。筛选出骨骼样本差异表达基因通路分析结果中富集程度在前10位的通路与基因，见表2。在所涉及通路中已知与骨骼发育相关的差异表达通路为P53、MAPK signaling pathway、Wnt signaling pathway、Cysteine and methionine metabolism、Notch、Jak-STAT signaling pathway、PPAR signaling pathway、Terpenoid backbone biosynthesis、Insulin signaling pathway、Calcium signaling pathway、Hedgehog signaling pathway等。上述通路中所涉及重要基因WNT10B，IKbKb，FGF11等表达明显子异常。

3 讨 论

骨骼组织的发育受到多种基因的调控，一旦基因在自我更新的过程中受到外界物理、化学和生物因素的影响后基因的表达发生改变，导致骨骼发育异常。目前表达谱基因芯片在动物基因组和毒理基因组学中发挥重要作用。近年来有报道用基因芯片技术研究氟中毒对骨骼发育的影响，但DON 作为导致骨骼畸形的一个生物因素，其分子机制尚未见报道。

本研究应用基因本体学对差异表达基因的生物学功能进行注释和基因分类，在生物过程中，生物调节相关的差异表达基因占18%，包括细胞周期代谢过程的调节、大分子代谢过程的调节和基因表达调节等，这提示DON影响细胞代谢过程和骨骼发育基因的异常表达，导致骨骼发育异常。而在分子功能中发现，36%的差异表达基因与结合有关，主要为蛋白结合、离子结合与阳离子结合等。早在90年代Sergeev等［5］就证明口服DON可导致小鼠体内钙平衡紊乱。DON可能通过改变Ca2+浓度，造成成骨细胞增殖异常，出现骨骼发育障碍。

在差异表达的基因中Pax1编码的蛋白质可作为上游主调控因子在多个细胞信号传导通路中起重要作用。在胚胎发育过程中可调控细胞分化、更新和凋亡。即使对一些已经发生特定分化的细胞，对其细胞功能的保持也起到重要调控作用［5］，目前研究表明，Pax 基因的非正常表达会导致多种器官组织发育畸形［6］。 在敲除Pax1和Pax9基因的小鼠胚胎发育过程中完全观察不到脊柱形成，Pax1或Pax9单个基因缺失的小鼠胚胎表现为不同程度的脊柱畸形［7-8］。本研究结果显示，Pax1基因表达上调2.548倍，差异显著，经RTPCR检测发现，DON作用于成骨细胞使Pax1基因表达上调，其mRNA转录水平增加，以此推论DON导致的骨骼畸形可能与Pax1基因表达上调有关。

Runx2基因是成骨细胞内的特异性转录因子，其功能主要是促进成骨细胞的分化和抑制成骨细胞成熟，Enomoto等［9］使用 Runx2基因缺陷的小鼠为研究对象，发现Runx2缺失使小鼠颅骨细胞无法分化为成骨细胞。Takeda等［10］使用转基因小鼠研究发现，Runx2可以促使软骨细胞发育成熟，使用显性负突变的DNRunx2抑制了软骨细胞的成熟。本研究显示DON处理后Runx2基因表达下调2.269倍，且小鼠成骨细胞内Runx2基因随着DON浓度的增加，表达量明显降低。小鼠成骨细胞在DON的影响下，周期分布改变，凋亡率增加，Runx2基因表达下调，可导致小鼠出现骨骼畸形，为今后DON致畸的研究以及临床治疗提供了理论依据。

差异表达基因信号传导通路分析结果表明，未发现已知的与骨骼发育密切相关的BMP信号通路，而癌症发生通路富集基因最多，共有15个差异基因，几个重要的与骨骼发育、成骨细胞分化等有关的基因如PRKCA、FGF、WNT10B和MAPK8均为下调基因，说明DON影响许多相关基因的共同改变才可以产生细胞表型效应。该信号传导通路在DON致骨骼畸形中的作用机制有待深入研究。

其中P53作为抑癌基因，P53蛋白在调节细胞增殖、DNA修复和凋亡等过程中起关键作用。有研究表明P53与调节成骨细胞分化、骨骼形成有关，P53通过DNA结合依赖的最小启动，抑制osterix的转录，P53缺失小鼠增加巨噬细胞集落刺激因子，有利于成骨细胞的分化［11］。本研究表明，DON影响P53信号途径中共涉及8个基因，6个上调基因，只有STEAP3和PTEN为下调基因，在上调基因中Gadd45b，差异近2倍，为已知的P53应答基因，其产物过表达引起细胞周期在G1期停滞。下调2.2倍的PTEN基因10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物，是一个重要的抑癌分子，位于10q23.3，转录产物为515 k b的mRNA。其蛋白产物有一酪蛋白磷酸酶的功能区和约175个氨基酸左右的与骨架蛋白tenasin，auxilin同源的区域。PTEN基因可能通过去磷酸化参与细胞调控。其可能与酪氨酸激酶竞争共同的底物，在肿瘤的发生，发展中起重要作用。P53蛋白是脊柱动物DNA损伤响应调控因子，有研究证明，DON可导致DNA断裂和损伤［12］，DNA链断裂是P53依赖性细胞凋亡的诱因之一，骨组织细胞凋亡导致骨骼发育异常。PTEN在骨代谢调控和骨稳态维持中具有重要的作用，PTEN基因敲除导致骨质硬化症［13］。P53如何对PTEN的功能失调产生应答需进一步研究。

Wnt信号通路通过调节胚胎期软骨发育，以及出生后软骨发生、成骨细胞和破骨细胞生成、软骨内成骨、骨重塑、骨折修复等过程，调控骨骼系统相关疾病和骨代谢。近年研究表明，Wnt通路在人类胚胎发育、细胞增殖与分化、肿瘤发生、骨关节系统疾病中发挥重要作用［14］。其通过在细胞分化不同阶段的正向和负向调控机制，保证了软骨细胞在特定位置以合适的速率稳定有序分化。在Wnt家族及其作用途径的相关信号分子中，无论何种分子和亚型的异常表达都可能破坏Wnt系统维系的正负平衡机制，导致骨骼系统畸形。本研究发现，DON致胎鼠畸形骨骼组织中Wnt信号的改变涉及10个基因，其中5个上调，5个下调，重要的基因Wnt10b下调1.7倍，有研究表明Wnt10b的信号抑制脂肪细胞并刺激造骨细胞生长，即减少脂肪，增加骨骼［15］。实验发现，骨髓中Wnt10b的高水平表达能直接增加小鼠骨头的密度和重量。且研究确定出调节骨骼形成的Wnt家族中的一种特殊信号蛋白的功能。

总之，我们首次通过cDNA基因芯片高通量的筛选DON引起小鼠骨骼组织差异表达基因。本研究通过对上述差异基因的通路分析，经DAVID database数据库筛选共涉及通路153条，其中与骨骼发育密切相关的共8条，并对其与骨骼发育过程中的相关关系进行分析，探讨DON可引起骨骼畸形通路的相关基因及其功能，为深入研究DON引起骨骼畸形的分子机制奠定了理论基础。

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Differential gene expression and related pathways of skeletal malformations induced by deoxynivalenol in mice

LI Yan，ZHAO Yinghui，ZHUANG Dongming，LI Xiaoxia，YU Ailian*
（School of Basic Medicine Sciences， Taishan Medical University， Tai’an 271000， Shandong， China）

目的： 筛选脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）致小鼠胚胎畸形骨骼组织的差异表达基因及相关信号传导通路，从基因水平上阐明DON致小鼠骨骼畸形的分子基础。方法：取孕期小鼠30只，随机分成3个不同浓度DON染毒组、溶剂对照组和空白对照组，每组6只，将DON染毒组孕鼠于孕期第7～10天连续腹腔注射DON，染毒后第18天麻醉剖腹取出胎鼠骨骼组织，提取椎骨骨骼组织总RNA，通过反转录法获取畸形骨骼组织和正常对照组骨骼组织的cDNA，并对其分别进行荧光标记，采用全基因组芯片技术对小鼠胚胎畸形骨骼组织与正常对照组织的差异基因表达谱进行分析，采用基因本体学分析软件对差异表达基因进行功能分析，DAVID database数据库筛选差异表达基因涉及的信号通路，并利用荧光定量PCR（qPCR）技术对基因芯片结果进行验证。结果：在DON染毒组小鼠全基因组芯片上筛选出差异基因282个，其中下调148个，上调134个；在差异表达基因分析的基础上，发现差异表达基因涉及到的通路有153个。qPCR结果表明，上调基因Fbn1、Co19a2、Papss2、Pax1F和下调基因Runx2、Pthlh等6个差异表达基因的相对定量结果与基因芯片检验结果表达趋势一致。结论：应用基因表达谱芯片初步筛选出DON所致胎鼠畸形骨骼与正常胎鼠骨骼组织中的差异表达基因，并通过通路分析发现，上述差异表达基因涉及多条信号传导通路。

脱氧雪腐镰刀菌烯醇；骨骼畸形；基因芯片；差异表达基因；传导通路

OBJECTIVE:To screen the differential gene expression and related pathways of fetal skeletal malformations induced by deoxynivalenol（DON） in mice，and to explore the mechanism of deformities induced by DON at the molecular level.METHODS：30 pregnant mice were randomly divided into 3 experimental groups and 2 control groups，6 in each group. DON injection was performed from days 7 to 10 of pregnancy by intraperitoneal injection into pregnant mice. At GD 18，all mice were killed under isoflurane anesthesia，and vertebral bone tissue of fetuses were collected. Total RNA of vertebral bone tissues was extracted and cDNA was obtained by RT-PCR. Using whole genome microarray technology，the gene expression profiles and the pathways of the rat vertebral bone tissue were studied. Analysis of the function of differentially expressed genes was performed by using software of gene ontology. Screening signaling pathways of differentially expressed genes was done by DAVID database. The results were verified by fluorescence quantitative PCR（qPCR） technology.RESULTS：Microarray analysis showed that 282 genes，including 148 downregulated and 134 up-regulated genes，were abnormally expressed in fetal vertebral bones after maternal DON exposure. 153 pathways were related to the differentially expressed genes. The relative quantitative results of qPCR were consistent with the results of gene chip test in Fbn1，Co19a2，Papss2， Pax1，Runx2 and Pthlh genes.CONCLUSION：There were differential gene expressions in deformed fetal skeleton between deoxynivalenol-treated rats and normal rats，involving multiple signaling pathways. The differentially expressed genes and signaling pathways may be related to themolecular mechanisms of deformities induced by DON.

deoxynivalenol；skeletal d eformities；gene c hip；differentially e xpressed g enes；signaling p athways

Q344*.13

A

1004-616X（2015）01-0001-05

10.3969/j.issn.1004-616x.2015.01.001

2014-05-11；

2014-01-06

山东省科技攻关项目（2007GG30002016）；国家传染病重大专项合作项目（2009ZX10004-216）；山东省自然科学基金（ZR2013HL060）

作者信息：李岩，E-mail：liyan2313935@163.com。*通信作者，于爱莲，E-mail:alyu@tsmc.edu.cn