不同浓度的糜酶对自发性高血压大鼠心肌肥厚细胞的构建

宋　晶　郭家娟　李相军崔英子　魏　岩　(长春中医药大学附属医院，吉林　长春　3002)



不同浓度的糜酶对自发性高血压大鼠心肌肥厚细胞的构建

宋晶郭家娟李相军1崔英子魏岩(长春中医药大学附属医院，吉林长春130021)

〔摘要〕目的探讨糜酶对自发性高血压大鼠(SHR)心室肥厚模型的最佳诱导时间及浓度。方法将肥厚心肌细胞分为对照组(加无血清DMEM培养液)和实验组。实验组分别给予糜酶(chymase)7. 5、15、30和60 μg/L 4个浓度组，分别培养24、48 h，诱导小鼠心肌细胞肥大，测定培养液中AngⅡ浓度、β-actin和ANP基因表达以评价模型是否成功。结果实验组中糜酶浓度为30 μg/L，培养48 h后培养液中AngⅡ浓度明显高于对照组(P＜0. 05);并且糜酶浓度为30 μg/L，培养48 h后培养液中细胞β-actin和ANP基因表达高于对照组(P＜0. 05)。结论糜酶浓度在30 μg/L、培养48 h为诱导SHR心肌肥厚的最佳浓度及时间。

〔关键词〕糜酶;自发性高血压大鼠;心肌肥厚

1吉林大学药学院

第一作者:宋晶(1987-)，女，在读硕士，主要从事心血管疾病研究。

左心室肥厚是原发性高血压(EH)导致靶器官损伤中最严重的类型，会引发恶性心律失常、心肌梗死、心衰等连锁反应。研究表明，抑制左心室肥厚会抑制这种连锁反应的发生，从而减少心血管事件的发病率和死亡率〔1〕。肾素-血管紧张素系统(RAS)在调节容量超负荷或压力超负荷导致的心肌肥厚中起重要作用〔2〕;心肌细胞肌蛋白合成，导致心肌细胞肥大，从而发生心肌肥厚。血管紧张素(Ang)Ⅱ是目前最强的促心肌细胞肌蛋白合成因子〔3〕。而在心脏组织中，糜酶(Chymase)是AngⅡ形成的主要酶类之一，β-actin和ANP基因表达为心肌肥厚的重要标志。检测AngⅡ及相关信号分子基因、蛋白的表达，多层次、多角度系统研究糜酶AngⅡ途径干预心室肥厚机制，可以进一步丰富以心室肥厚为重要病理环节的心血管治疗研究思路。

1　材料与方法

1. 1材料纯化肥大细胞糜酶(Merck公司); AngⅡ放射免疫

分析试剂盒(上海伟寰生物科技有限公司);心肌细胞株H9c2(上海艾研生物科技有限公司);血清DMEM培养液(上海杰美基因医药科技有限公司)

1. 2方法将大鼠心肌细胞分为对照组(加无血清DMEM培养液)和不同剂量糜酶刺激组，后者将糜酶加入到无血清DMEM培养液中致糜酶终浓度为7. 5、15、30和60 μg/L，分别培养24 h和48 h后检测各组培养上清AngⅡ含量及细胞β-actin和ANP基因表达。

1. 2. 1 AngⅡ浓度测定用AngⅡ放射免疫分析试剂盒测定。将细胞(105个/孔)接种于24孔板，培养48 h，每孔吸取800 μl培养液，加入装有20 μl预冷的糜酶培养液(浓度分别为7. 5、15、30和60 μg/L)的管中，离心5 min(4℃，300 r/min)，取上清液，采用AngⅡ放射免疫分析试剂盒测定。

1. 2. 2采用逆转录Real-time PCR法检测各组细胞β-actin、ANP基因

1. 2. 2. 1 PCR反应引物ANP基因:正向序列5＇-gga gcc tgc gaa ggt caa-3＇，反向序列5＇-tat ctt cgg tac cgg aag ctg t-3＇;β-actin:正向序列5＇-ccc gcg agt aca acc ttc t-3＇，反向序列5＇-cgt cat cca tgg cga act-3＇。

1. 2. 2. 2提取心肌细胞总RNA使用0. 25%胰蛋白酶-EDTA对心肌细胞进行消化后，Hank液重悬细胞并转至10 ml离心管中;悬浮培养细胞则直接转到离心管中; 2 000 r/min离心10 min;加入Hank液，再离心、洗涤各两次，去除上清液，冰浴(之后各项操作均在冰浴中进行)。收获细胞(5×106/L)，并将其移入到1. 5 ml Ep管内。加入1 ml TRIzol试剂，混合均匀，放置于室温中5 min;加入0. 2 ml氯仿，振摇时间为15 s，室温下放置3 min; 4℃、10 000 r/min离心5 min，吸取上层水相转移至新Ep管中，加入0. 5 ml的异丙醇，放置于室温中10 min; 4℃条件下进行低温离心，10 000 r/min离心10 min，加入75%的1 ml乙醇，进行摇振，再对其充分洗涤和沉淀，4℃、5 000 r/min离心5 min，弃上清液，真空干燥处理，沉淀重悬于100 μl的无RNase水中。保存于－70℃条件下备用;并用紫外分光光度计检测RNA浓度和纯度。

1. 2. 2. 3 PCR扩增依照PCR反应试剂盒说明书步骤操作，将上游引物和下游引物各1 μl，Superscript/Tag混合物1 μl，待测RNA 1 μg，纯水50 μl混合均匀，再加入30 μl石蜡。反应条件: 55℃15 min，94℃12 min，1个循环; 94℃15 s，55℃30 s，72℃1 min，35个循环; 72℃10 min，1个循环。

1. 2. 2. 4 PCR产物电泳制取1. 5%琼脂糖凝胶(含溴乙锭0. 3 mg/ml)，取PCR产物10 μl进行电泳，电泳后将凝胶取出，将其放置于紫外分析仪内进行观察并对其进行定量分析，用待测基因/GAPDH比值代表待测ANP基因和β-actin mRNA的相对水平。

1. 3统计学方法采用SPSS18. 0软件行单因素方差分析、t检验。

2　结果

糜酶浓度为30 μg/L，培养时间24 h、48 h时，AngⅡ浓度与对照组比较均有显著差异(P＜0. 05)，同浓度糜酶培养48 h与培养24 h AngⅡ浓度比较有统计学意义(P＜0. 05);糜酶浓度为30 μg/L，培养时间24 h、48 h时，细胞中β-actin、ANP的含量与对照组比较均有显著差异(P＜0. 05);相同浓度糜酶培养48 h与培养24 h，细胞中ANP含量比较有统计学意义(P＜0. 05)。见表1。

表1　测得培养液中AngⅡ、β-actin、ANP的浓度(x±s)

3　讨论

RAS系统在调节前后负荷导致的心肌肥厚中起重要作用〔2〕，其中AngⅡ占主导地位。近年来研究证实，人类心肌局部AngⅡ主要来源于血管紧张素转换酶(ACE)和糜酶两条途径，在人体心脏80%的AngⅡ通过糜酶产生。多项研究证实，糜酶在心室肥厚、心肌纤维化及心衰的发生、发展中起重要作用〔4〕。大量研究表明，β-actin作为Wnt/β-actin信号通路的关键成员在介导信号转导过程中调控细胞的增殖和凋亡〔5〕。ANP基因表达为心肌肥厚的重要标志，在正常心肌组织中表达量很低，如果检测到其表达量明显增加，为病理性心肌肥大的可靠指标。本研究同时以β-actin和ANP基因两种指标作为研究对象，使研究结果更加严谨可靠。而实验结果说明不同浓度的糜酶刺激心肌细胞，使细胞内AngⅡ浓度增高，细胞中肥大基因(β-actin、ANP)表达，导致心肌细胞肥大。而细胞内AngⅡ浓度、β-actin与ANP的基因表达与糜酶浓度以及培养时间密切相关。通过测定实验指标，糜酶浓度在30 μg/L、培养48 h时，为最佳诱导浓度及时间。

左心室肥厚为高血压患者中最常见的并发症之一，严重影响人类的生活质量，将血压维持在正常水平，可有效减少并发症;去除引起并发症的诱因，可减少并发症的发生，同时亦可通过此法，将血压维持在正常水平。本实验为临床上治疗高血压、减少高血压引起的心肌肥厚提供了良好的理论依据。

4参考文献

1 Okin PM，Devereux RB，Jem S，et al．Regression of electrocardiographic left ventricular hypertrophy during antihypertensive treatment and the prediction of major cardiovascular events〔J〕．JAMA，2004; 292: 2396-8．

2 Uechi M，Tanaka Y，Aramaki Y，et al．Evaluation of the renin-angiotensin system in cardiac tissues of cats with pressure-overload cardiac hypertrophy〔J〕．Am J Vet Res，2008; 69(3): 343-8．

3 Jiang XY，Gao GD，Du XJ，et al．The signaling of AT2 and the influence on the collagen metabolism of AT2 receptor in adult rat cardiac fibroblasts 〔J〕．Acta Cardiol，2007; 62(5): 429-38．

4 Palaniyandi SS，Nagai Y，Watanabe K，et al．Chymase inhibition reduce the progression to heart failure after autoimmune myocarditis in rats〔J〕．Exp Biol Med(Maywood)，2007; 232(9): 1213-21．

5周焕发，赵红斌，杨银书，等.多氯联苯对大鼠肾脏c-fos、c-Myc和βcatenin表达影响的研究〔J〕．癌变·畸变·突变，2010; 6(11): 448-51.

〔2015-02-19修回〕

(编辑徐杰)

通讯作者:郭家娟(1978-)，女，博士，副主任医师，硕士生导师，主要从事心血管疾病研究。

基金项目:教育部科学技术研究重点项目(211041)

〔文章编号〕1005-9202(2015)20-5751-02;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2015. 20. 030

〔文献标识码〕A

〔中图分类号〕R544