贝那普利与丙泊酚联合对糖尿病模型大鼠心肌缺血再灌注的影响

郝丽娜　侯少科　李建辉　曲振华　(邢台市人民医院麻醉科，河北　邢台　054000)



贝那普利与丙泊酚联合对糖尿病模型大鼠心肌缺血再灌注的影响

郝丽娜侯少科李建辉曲振华(邢台市人民医院麻醉科，河北邢台054000)

〔摘要〕目的研究贝那普利预处理后联合丙泊酚对糖尿病模型大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响。方法选用成年大鼠60只，成功制备糖尿病模型后随机分为模拟手术过程组，模型组，丙泊酚组，贝那普利组及贝那普利联合丙泊酚组。再灌注完成后即刻测检各项心肌酶(乳酸脱氢酶、肌酸激酶和肌酸激酶同工酶)、心肌组织中SOD活性、丙二醛含量;测定Caspase-3表达;应用Western印迹法测定Akt的磷酸化(p-Akt)水平。结果丙泊酚单独应用对3项观察指标都有显著影响，有较好的心肌保护作用;贝那普利单独应用有轻微的心肌保护作用(只影响心肌酶);贝那普利联合丙泊酚用药后作用较丙泊酚单独应用对大鼠心肌缺血再灌注的保护作用进一步增强。结论贝纳普利单独应用对心肌的保护作用有限，但与丙泊酚联合用药能显著增强对糖尿病大鼠心肌缺血再灌注的保护作用。

〔关键词〕丙泊酚;贝那普利;糖尿病;缺血再灌注

氧化应激反应与糖尿病并发症的产生及进展有着很密切的关系，针对氧化反应的抗氧化治疗可减轻心肌细胞及心肌组织的损伤。丙泊酚是一种镇静剂，有抗氧化作用，可有效减轻心肌缺血再灌注损伤，产生确切的心肌保护作用〔1～3〕。有研究表明，与单纯一种预处理方法比较，不同预处理方法联合应用时减轻心肌缺血再灌注的效应增强;但也有不同的结论〔4～6〕。本研究观察贝那普利、丙泊酚以及二者联合处理对糖尿病模型大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用。

1　材料与方法

1. 1动物选择及制备糖尿病模型选用河北省实验动物中心提供的成年健康SD大鼠，雌雄不限，体重260～320 g。遵守《实验动物福利和应用指南》。参照文献〔7〕制备大鼠2型糖尿病模型。高脂高糖喂养5 w后，腹腔注射链脲佐菌素(STZ，Sigma公司，美国，溶解于柠檬酸缓冲液中)30 mg/kg，1次/d，连续2 d; 72 h后尾静脉采血测定空腹血糖，以血糖≥16. 7 mmol/L，并出现明显多尿和多饮为2型糖尿病模型制备成功。

1. 2分组及制备缺血再灌注模型麻醉大鼠，然后气管插管进行机械通气。股动、静脉置管分别连接于麻醉监测仪和微量输液泵用于监测血压和给药，连接Ⅲ导联心电监测。待血压和心率稳定后，开胸，暴露心脏，在冠脉左前降支(LAD)下方穿线，结扎线下垫硬管，以便松开结扎线恢复血流。缺血30 min，再灌注2 h制备大鼠心肌缺血再灌注损伤模型。模型是否成功的检查方法:结扎部位远端心肌颜色变成暗红色，在心电图上可见S-T段显著抬高以及T波高耸。

取糖尿病模型制备成功的大鼠60只，采用随机数字表法分为5组(n=12):模拟手术过程组:开胸，分离冠脉左前降支，只穿线，不结扎，不阻断血流，不造成心肌缺血。模型组:阻断LAD 30 min后给予生理盐水再灌注2 h，制造缺血再灌注模型;丙泊酚组:从缺血之前10 min开始持续静脉滴注丙泊酚8 mg·kg－1·h－1，其余操作同模型组;贝那普利组:术前12 h灌胃贝那普利6 mg/kg(以0. 5%羧甲基纤维素钠配制)，其余操作同模型组。丙泊酚、贝那普利联合用药组:术前12 h灌胃贝那普利6 mg/kg(以0. 5%羧甲基纤维素钠配制)，其余操作同丙泊酚组。

1. 3心肌酶检测再灌注操作完成后立即采集颈动脉血液，在4℃条件下以3 000 r/min速度离心10 min，抽上清液，严格按照试剂说明书，在生化分析仪上测定乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)和肌酸激酶同工酶(CK-MB)。

1. 4心肌组织中超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量再灌注操作完成后摘取心脏，剪取梗死区域及部分边缘组织，洗净血液之后制成匀浆，此过程中均用冰生理盐水。取上清液步骤同上，检测匀浆SOD活性以及MDA含量。按试剂盒说明书操作。

1. 5免疫组化方法测定Caspase-3表达自结扎点远端，左心室等厚切为甲、乙2份(均包括正常区和危险区)。取甲份心肌组织按下列步骤处理:用10%甲醛固定，石蜡包埋，切片之后脱蜡处理，加入1∶100兔抗大鼠Caspase-3多克隆抗体4℃过夜。再加入生物素化二抗，加入过氧化物酶标记的链霉亲和素，DAB显色，苏木精复染，梯度酒精脱水，采用二甲苯中性透明树胶封片。显微镜观察显示若为棕黄色颗粒即是Caspase-3蛋白阳性反应，于光学显微镜下400倍放大，随机选择无重叠的5个视野，用Image-ProPlus图像分析软件分析Caspase-3吸光度。

1. 6 Western印迹法测定Akt的磷酸化(p-Akt)水平取乙份心肌组织提取总蛋白，定量分装，－70℃保存，取蛋白提取液上清液，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转移至硝酸纤维素膜，封闭洗脱，分别加入1∶1 000兔抗大鼠Akt和P-Akt(Ser473)多克隆抗体，4℃过夜，洗膜，二抗孵育，以β-肌动蛋白为对照调整上样量，用ECL法显示，暗室X光胶片曝光，用Image-ProPlus图像分析软件进行分析。蛋白含量以目的蛋白与β-肌动蛋白条带吸光度比值计算，Akt的磷酸化水平以P-Akt蛋白占Akt总蛋白的百分数来表示。

1. 7统计学处理采用SPSS17. 0软件，两组之间比较采用单因素方差分析，两两比较采用q检验;采用Pearson法进行两变量间的相关分析。

2　结果

2. 1对各项心肌酶活性的影响模型组血清中各项心肌酶活性较模拟手术过程组升高(P＜0. 05);与模型组比较，贝那普利组、丙泊酚组以及联合用药组可明显降低各项心肌酶活性(P＜0. 05);贝那普利组较丙泊酚组高(P＜0. 05)，联合用药组较丙泊酚组低(P＜0. 05)，见表1。

2. 2对心肌组织SOD活性和MUA含量的影响模型组心肌组织SOD活性较模拟手术过程组降低MDA含量升高(P＜0. 05);贝那普利组有使SOD活性增高及MDA含量降低的趋势，但与模型组比较无统计学意义(P＞0. 05)。丙泊酚组及联合用药组与模型组比较，可明显升高SOD活性、降低MDA含量(P＜0. 05);联合用药组较丙泊酚组改变更多(P＜0. 05)，见表2。

2. 3对Caspase-3表达及P-Akt水平的影响模拟手术组冠脉LAD支配区心肌细胞组织中无或仅有个别心肌细胞Caspase-3呈弱阳性表达(0. 21±0. 04);模型组LAD支配区缺血半暗带心肌细胞组织中Caspase-3呈强阳性片状表达，黄色颗粒即为其阳性反应产物，主要在胞质中表达(6. 14±0. 52，P＜0. 05);丙泊酚组(1. 89±0. 31)和联合用药组心肌中Caspase-3的表达与模型组相比明显减少和(1. 52±0. 23，均P＜0. 05)，且联合用药组小于丙泊酚组(P＜0. 05);而贝那普利组与模型组比较Caspase-3的表达无统计学差异(5. 98±0. 46，P＞0. 05)。

表1　各组CK、CK-MB、LDH水平比较(n=12，x±s)

表2　各组心肌组织SOD活性及MDA含量的比较(n=12，x±s)

五组的Akt总表达量之间无明显差异(P＞0. 05)。与模拟手术过程组(23. 2±3. 5)比较，模型组(11. 8±2. 1)和贝那普利组(14. 6±2. 4)的p-Akt(62. 4±3. 7)水平降低(均P＜0. 05)，丙泊酚组(62. 4±3. 7)和联合用药组(58. 2±4. 3)P-Akt水平升高(P＜0. 05);与模型组比较，丙泊酚组和联合用药组P-Akt水平明显升高(均P＜0. 05);而贝那普利组与模型组比较差异无统计学意义(P＞0. 05)。

3　讨论

糖尿病患者的心肌组织存在着不同于一般患者的病理生理改变，如内分泌代谢紊乱、心肌肥大、钙平衡调节异常等，这些异常改变很可能使糖尿病心肌对缺血再灌注损伤的反应性与一般患者的不同，对一般患者具有保护作用的药物或治疗用在糖尿病患者身上，可能会发生作用减弱或消失。以往研究已经证实丙泊酚能够减轻心肌的缺血再灌注损伤，但是丙泊酚对糖尿病心肌缺血再灌注损伤是否同样具有保护作用?血管紧张素转化酶抑制剂可减少血管紧张素Ⅱ的形成，抑制缓激肽的降解，扩张冠状动脉，改善微循环，改善心肌能量代谢。广泛用于治疗高血压、心功能不全。贝那普利是临床常用的一类血管紧张素转化酶抑制剂。心肌缺血再灌注损伤的确切机制尚未完全清楚，通常认为是多方面、多个机制联合作用的结果〔8，9〕。采用多种不同保护机制的药物联合使用，是否能够增强对心肌的保护作用?

血清心肌酶学的升高幅度与心脏损伤的严重程度呈正相关，与预后呈负相关。本实验结果显示，丙泊酚和贝那普利单独应用时均可降低各项心肌酶活性，丙泊酚的心肌保护作用较贝那普利强，联合用药后作用增强。

实验结果表明，丙泊酚联合贝那普利可有效减轻缺血再灌注对糖尿病大鼠心肌造成的损伤。在心肌缺血再灌注模型中血管紧张素Ⅱ增多，而血管紧张素Ⅱ增多是导致心肌缺血再灌注损伤的原因之一〔10〕。血管紧张素Ⅱ一方面作用在AT1受体，可引起血管收缩，导致心肌耗氧量增加，直接对心肌细胞产生毒性作用;另外一方面还可引起醛固酮分泌增多，导致水钠潴留，循环血量增加，从而导致心血管负荷加重，减少缓激肽的降解，对心肌造成伤害。血管紧张素转化酶抑制剂能抑制血管紧张素Ⅱ生成，从而减轻缺血再灌注损伤。

糖尿病模型大鼠心肌组织中本来存在自由基生成过多、抗氧化酶活性降低，自由基不能及时有效清除，使脂质过氧化反应增强等问题。如果在此基础上加上心肌缺血再灌注，那么自由基将进一步增多，导致组织的脂质过氧化反应进一步增强，促进膜蛋白和磷脂交联，引起相应蛋白质的不可逆变性，导致细胞结构和功能损伤。SOD是内源性自由基清除系统的主要成员，其活性降低必然导致氧自由基的积聚，从而使细胞膜发生脂质过氧化反应，引起代谢产物MDA的含量增多，MDA的增多对心肌细胞膜有很强的破坏作用。因此，丙二醛含量和SOD活性可反映机体清除氧自由基的能力，从而间接反映氧化应激反应程度〔11，12〕。

本实验结果也提示心肌在缺血再灌注之后会产生大量的氧自由基，介导了过氧化反应。丙泊酚可能是对氧化应激中的多个环节产生影响〔13，14〕，其化学结构类似于内源性抗氧化剂维生素E，可直接与自由基结合，使自由基失去活性，从而减少自由基对心肌细胞的损伤。本实验证实丙泊酚单独应用可提高SOD活性，降低MDA含量。贝那普利虽然单独应用与模型组无显著性差异，但联合丙泊酚应用作用较丙泊酚进一步增强。

细胞凋亡与糖尿病心血管并发症及心肌缺血再灌注损伤密切相关，糖尿病所致心肌病变的发生发展过程中存在着心肌细胞凋亡〔15〕。糖尿病心肌本来已经存在着氧化应激，在此基础上的缺血再灌注必然使活性氧的生成进一步增加，这也是引起心肌缺血再灌注损伤的重要原因。细胞凋亡的关键蛋白酶之一就是Caspase-3，Caspase-3是白介素转换酶家族成员，是凋亡过程末段关键蛋白酶，也是凋亡程序的效应分子。虽然在心肌缺血再灌注过程中的细胞凋亡机制尚未完全清楚，但Caspase-3的活化是目前公认的凋亡的最后通路，它的活化可以使核酸内切酶激活，使DNA修复酶失活以及细胞骨架蛋白降解，进而导致细胞凋亡〔16～18〕。Akt是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶中的一种，通常为PI3K下游的目标蛋白，Akt磷酸化是Akt激活的必要条件，当细胞膜表面受到前程信号刺激时，引起Akt磷酸化，从而使其激活，活化Akt又可引起糖原合酶激酶-3、Caspase-3等下游底物磷酸化，经过这样一系列复杂过程最后起到促细胞生存和抗凋亡的作用。Akt的活化程度通常采用PAkt蛋白与总Akt蛋白含量的比值来表示〔19～21〕。本研究结果提示Akt以及Caspase-3蛋白参与了心肌组织缺血再灌注时细胞凋亡的发生。Caspase-3表达与心肌细胞凋亡之间呈正相关，丙泊酚可抑制Caspase-3的表达，增加Akt的磷酸化水平，提示丙泊酚可以促进Akt活化来抑制其下游底物Caspase-3的表达。贝那普利虽然单独应用与模型组无显著差异，但联合丙泊酚用药后作用较丙泊酚单独应用对大鼠心肌缺血再灌注的保护作用进一步增强。

综上所述，丙泊酚对糖尿病心肌在缺血再灌注时有较好的保护作用;贝那普利单独应用只影响心肌酶，对心肌保护作用有限;贝那普利与丙泊酚联合用药能显著增强其作用，推测其机制可能与抑制血管紧张素Ⅱ的生成有关，其确切作用机制有待于进一步探讨。

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〔2015-02-26修回〕

(编辑李相军)

基金项目:邢台市科技支撑计划项目(No．2014ZC168)

〔文章编号〕1005-9202(2015)20-5744-04;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2015. 20. 027

〔文献标识码〕A

〔中图分类号〕R614. 2

第一作者:郝丽娜(1981-)，女，主治医师，主要从事心血管麻醉、临床麻醉研究。