热休克蛋白90、缺氧诱导因子-1α在大肠癌中的表达及意义

任亚君　熊枝繁　曹仕琼　熊莉娜　涂　艳张　芹熊　亮程汉英(华中科技大学同济医学院附属梨园医院消化内科，湖北　武汉　40077)



热休克蛋白90、缺氧诱导因子-1α在大肠癌中的表达及意义

任亚君熊枝繁曹仕琼熊莉娜涂艳1张芹2熊亮3程汉英
(华中科技大学同济医学院附属梨园医院消化内科，湖北武汉430077)

〔摘要〕目的观察热休克蛋白90(HSP90)、缺氧诱导因子(HIF)-1α在大肠癌发生发展过程中的表达及意义。方法运用免疫组织化学法检测HSP90，HIF-1α两者在大肠癌及正常组织中的表达情况。结果HSP90、HIF-1α在正常大肠组织，大肠腺癌中的阳性率分别为: 30%、63. 0%; 15. 0%、71. 7%。两者在正常组织和大肠腺癌中的表达差异均有统计学意义(P = 0. 013，P＜0. 001)。HSP90蛋白的表达与大肠癌组织的分化程度，Duke分期及是否有淋巴结转移有关(P＜0. 05)，HIF-1α的表达与Duke分期及是否有淋巴结转移有关(P＜0. 05);通过相关性分析，两者具有明显相关性(P＜0. 01)。结论HSP90，HIF-1α可能与大肠腺癌的发生、浸润及转移有关;两者的协同作用可能参与了大肠癌的发生发展。

〔关键词〕大肠癌;热休克蛋白(HSP)90;缺氧诱导因子(HIF)-1α;免疫组织化学

1华中科技大学同济医学院附属梨园医院老年病科

2华中科技大学同济医学院附属梨园医院病理科

3华中科技大学同济医学院附属梨园医院检验科

第一作者:任亚君(1987-)，女，在读博士，主要从事细胞因子与消化道肿瘤的关系研究。

大肠癌近年来发病率有增高的趋势〔1〕。热休克蛋白(HSP)90，对血管形成，肿瘤的侵袭转移，肿瘤细胞增殖，细胞周期进程及凋亡的信号转导通路中多种致癌蛋白的构象、稳定性及功能的维持均很重要〔2〕。缺氧诱导因子(HIF)-1α，对肿瘤的血管再生，糖酵解代谢及肿瘤的侵袭性均有调节作用〔3～5〕。本研究通过免疫组织化学SABC法检测大肠癌组织中HSP90及HIF-1α的表达，观察两者与大肠癌临床病理特征的关系，探讨两者在大肠癌发生发展及侵袭转移过程中的作用。

1　资料与方法

1. 1一般资料选取华中科技大学同济医学院附属协和、梨园医院2004年1月至2012年10月病理科存档石蜡包埋组织及2012年10月至2013年1月期间手术切除的新鲜大肠癌组织，所有病例术前均未行放化疗，术后均经病理证实。大肠腺癌46例，男28例，女18例;年龄36～81(中位60. 5)岁，结肠癌25例，直肠癌21例;高中分化29例，低分化17例;有淋巴结转移16例，无淋巴结转移30例;例; Duke分期A+B期30例，C+D 期16例;同时取距离肿瘤10 cm以上正常组织20例作对照。

1. 2主要试剂鼠抗人HSP90单克隆抗体(1∶100稀释)，鼠抗人HIF-1α单克隆抗体(1∶100稀释)，均购自Abcam公司，二抗购自Vector公司，三抗购自Sigma公司。

1. 3方法所有标本均由4%多聚甲醛固定，常规脱水，透明，石蜡包埋，4 μm连续石蜡切片，烤片，脱蜡，入水，破膜，pH6. 0柠檬酸液中微波热修复中火5 min，停3 min，中火5 min; PBS清洗，加3%H2O2室温下避光反应30 min; PBS清洗，加1∶2 000稀释的酶k，于37℃温箱反应20 min，; PBS清洗，加2%BSA于37℃温箱反应30 min;甩液，加一抗，4℃孵育36 h，后室温复温2 h; PBS清洗，加二抗，37℃温箱孵育1 h; PBS清洗，加SABC 液37℃孵育1 h; PBS清洗，DAB显色8～10 min，苏木素复染，脱水，透明，封片，其中以PBS代替一抗为阴性对照，用已知HSP90及HIF-1α阳性的大肠癌组织切片作阳性对照。

1. 4结果判定每例切片随机抽取5个高倍镜视野，肿瘤细胞阳性率分值为:＜10%，0分; 10%～25%，1分; 26%～50%，2 分; 51%～75%，3分;＞75%，4分;染色强度评分为:无色，0分;淡黄色，1分;棕黄色，2分;褐色，3分。两者得分相乘，阴性≤2 分;阳性≥3分。

1. 5统计学方法采用SPSS12. 0软件进行χ2检验和Spearman等级相关分析。

2　结果

2. 1 HSP90与HIF-1α蛋白在大肠癌及正常组织中的表达HSP90主要表达在肿瘤细胞的胞质和胞核，为棕黄色颗粒(图1)，HSP90在正常组织，大肠腺癌中表达的阳性率分别为: 30. 0%，63. 0%，二者差异显著(P＜0. 05); HIF-1α主要表达在肿瘤细胞的胞质和(或)胞核，为棕黄色颗粒(图1)。HIF-1α在正常组织、大肠腺癌中表达的阳性率分别为: 15. 0%，71. 7%，二者差异显著(P＜0. 05，表2)。

2. 2 HSP90与HIF-1α蛋白在大肠癌中表达及其与大肠癌临床病理特征的关系HSP90表达与性别、年龄、部位无关(P＞0. 05);与分化程度、Duke分期及淋巴结转移有关(P＜0. 05)。HIF-1α表达与性别、年龄、部位、分化程度无关(P＞0. 05);与Duke分期及淋巴结转移有关(P＜0. 05)(表1)。

2. 3 HSP90与HIF-1α蛋白在大肠癌组织中表达的相关性HSP90与HIF-1α在大肠癌组织中表达的相关系数(r= 0. 420，P＜0. 01)，表明两者呈正相关。

表1　 HSP90与HIF-1α在大肠癌中的阳性表达与大肠癌临床病理特征的相关性〔n(%)〕

图1　 HSP90、HIF-1α在大肠癌组织中的表达(SABC法，×400)

3　讨论

肿瘤的发生发展及转移侵袭是多基因，多因素，多阶段共同作用的结果。HSPs又称分子伴侣，其氨基酸序列高度保守，是细胞内蛋白质平衡的主要调控者，指导胞质，内质网，线粒体内蛋白质的折叠，转运和细胞内定位，修复及降解变性蛋白，对错误折叠的蛋白质进行再折叠，防止蛋白质组错配与集聚，并参与真核细胞内多种调控蛋白的最后激活，参与多种大分子蛋白复合体的重构，包括参与信号转导，转录，细胞分裂，迁移及分化的蛋白质。在高温，重金属，缺氧及酸中毒等应激原存在的时候，其含量会增加〔6，7〕。

按分子量大小，HSPs可分为HSP110，90，70等〔8〕，HSP90即为分子量约90 kD的大分子蛋白质，主要由HSP90a，HSP90β组成，亦包含存在于内质网中的葡萄糖调节蛋白94(GRP94)及存在于线粒体中的TNF受体调控蛋白(TRAP1)〔9〕。生理状态下，HSP90占细胞内总蛋白量的1%～2%，在应激状态下，含量增长约2～10倍〔6，7，10〕。有研究表明在多种实体瘤(乳腺癌〔6〕，肝细胞性肝癌〔11〕，胃癌，鼻咽癌及卵巢癌〔12，13〕等)及血液学恶性肿瘤中表达均增加〔6〕。

HSP90的目的蛋白包括参与肿瘤细胞侵袭和转移的基质金属蛋白酶(MMP)2和尿激酶，维持血管再生的HIF、上皮生长因子受体(rEGFR)、类固醇受体辅助活化因子(SRC)等〔7，9〕，并通过调节蛋白激酶B(AKT)，肿瘤坏死因子受体(TNFR)，核因子κB的功能而抑制肿瘤细胞的凋亡。有研究示，结肠癌中HSP复合物表达水平与增殖细胞核抗原(PCNA)相关，认为HSP复合物可能与肿瘤细胞的快速增殖有关〔7，14〕。本研究表明在大肠癌组织中HSP90蛋白的表达明显高于正常组织，提示可能在大肠癌形成初，因体内已存在缺氧，酸中毒等应激源，从而使大肠癌组织中HSP90的表达量明显高于正常组织。

缺氧及遗传变异可通过多种途径使HIF-1α含量增加〔4，15～17〕。在多种肿瘤如结肠癌，乳腺癌，胃癌，肺癌，皮肤癌，卵巢癌，胰腺癌，前列腺癌和肾癌中均发现HIF-1α的高表达〔18〕。

HIF-1α作为转录激活因子，既参与13种不同的葡萄糖转运蛋白、糖酵解酶、VEGF基因的编码，又参与红细胞生成素、转铁蛋白、内皮素-1、诱导型合成酶、血红素氧化酶1、IGF-2、IGF结合蛋白2、3基因的编码，而这些蛋白质多数与肿瘤的发生发展相关〔3，18〕。有研究表明由于在结肠腺瘤及前列腺上皮内瘤变等良性病变中亦发现HIF-1α呈高表达〔18〕，提示HIF-1α的增多可能通过使利于肿瘤发生发展的多种基因高表达，从而为大肠癌的发生提供了有利的环境。另外，HIF-1亦可调控编码组织蛋白酶D，MMP2，尿激酶纤溶酶原激活物受体(uPAR)，纤连蛋白1，波形蛋白TGFα，自分泌移动因子，角蛋白14，18，19等已被确定在细胞侵袭的病理生理中起重要作用的蛋白的基因，且有研究表明即使是瞬间经历缺氧，肿瘤细胞对离体基底膜的侵袭力亦增加〔3〕，而本研究表明HIF-1α亦可能通过对参与肿瘤转移侵袭相关蛋白的基因调控，而对大肠癌的侵袭转移过程起重要作用。

本研究分析表明在大肠癌的发生发展及侵袭转移过程中两者可能起协同作用，考虑联合应用HSP90及HIF-1α的抑制剂可能会进一步提高大肠癌的治疗效果。

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〔2014-08-17修回〕

(编辑安冉冉/曹梦园)

通讯作者:熊枝繁(1962-)，男，硕士，主任医师，教授，博士生导师，主要从事细胞因子与消化道肿瘤的关系研究。

基金项目:湖北省科技计划自然科学基金课题(2011CDB368)

〔文章编号〕1005-9202(2015)20-5733-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2015. 20. 022

〔文献标识码〕A

〔中图分类号〕R574. 6