天麻多糖对H22荷瘤小鼠细胞周期及caspase蛋白活性的影响

刘现辉　郭晓娜展俊平　谢忠礼王君明张月藤陈玉龙李晓冰(河南省中医院，河南　郑州　45000)



天麻多糖对H22荷瘤小鼠细胞周期及caspase蛋白活性的影响

刘现辉郭晓娜1展俊平谢忠礼2王君明2张月藤3陈玉龙2李晓冰2
(河南省中医院，河南郑州450002)

〔摘要〕目的探讨天麻多糖对H22荷瘤小鼠细胞周期及caspase蛋白活性的影响。方法右侧腋窝接种H22肿瘤细胞制造荷瘤小鼠模型。实验设模型组、高剂量天麻多糖组、中剂量天麻多糖组、低剂量天麻多糖组及环磷酰胺(CTX)组。造模后给予天麻多糖或环磷酰胺治疗。实验结束处死小鼠，比较各组瘤重、抑瘤率、caspase-3，8，9及细胞周期分布状况。结果天麻多糖可明显减轻瘤重，高剂量天麻多糖抑瘤率可达44. 7%;与模型组比较，天麻多糖中、高剂量组可显著升高caspase-3，8，9水平及G0/G1期细胞百分数，降低G2/M期细胞百分数。结论天麻多糖对H22荷瘤小鼠具有显著的抑瘤作用，其作用机制可能与影响细胞周期分布，抑制细胞增殖并激活Caspase系统诱导肿瘤细胞凋亡有关。

〔关键词〕天麻;多糖;肿瘤

1黄河科技学院2河南中医学院3广州中医药大学

第一作者:刘现辉(1978-)，男，主治医师，硕士，主要从事免疫药理学研究。

天麻属兰科多年生草本寄生植物，以地下块茎入药，具有镇静、镇痛、抗惊厥、降压、抗炎、抗氧化、延缓衰老等作用〔1〕。天麻中含有天麻素、赤箭苷、胡萝卜苷、天麻多糖、腺嘌呤、腺嘌呤核苷、多种氨基酸等活性成分〔2〕。目前国内外对天麻化学成分报道较多的是酚类中的天麻素?和多糖类中的天麻多糖，天麻素和天麻多糖也是目前已知的天麻中的主要活性成分。研究表明，天麻多糖具有免疫调节、延缓衰老、降低血压、抑制病毒和抗抑郁等作用〔3〕。本研究旨在观察天麻多糖对H22荷瘤小鼠细胞周期及caspase蛋白活性的影响。

1　材料与方法

1. 1实验动物健康雄性BALB/C小鼠，18～22 g，由河南医科大学实验动物中心提供; H22肝癌细胞(H22)株，由中国中医科学院中药研究所药理室提供。

1. 2主要药物及试剂天麻多糖由西安慧科生物公司提供，批号20120620，纯度96. 5%;环磷酰胺(CTX)由上海华联制药有限公司生产，批号120706; caspase-3，8，9活性检测试剂盒购于深圳晶美生物工程有限公司;碘化丙啶(PI)购于上海生工生物技术有限公司。

1. 3动物模型及分组将H22腹水瘤小鼠乳白色浓稠腹水用生理盐水稀释至2×106个/ml且活细胞数大于95%，取0. 2 ml接种于健康小鼠右腋皮下。接种后按随机数字表分为模型组、CTX组、天麻多糖高剂量组、中剂量组及低剂量组。每组12只。

1. 4给药方法于造模后第2天各实验组开始用药。多糖高、中、低剂量组分别按320、160、80 mg/kg天麻多糖灌胃给药，1次/d，连续14 d; CTX组:按预实验结果CTX 15 mg·kg－1· d－1灌胃给药，1次/d，共10 d;模型组灌胃同体积生理盐水。实验第15天处死各实验组小鼠，无菌完整剥离肿瘤组织，用于瘤重称量、caspase活性测定及细胞周期分析。

1. 5检测指标与方法

1. 5. 1天麻多糖对H22荷瘤小鼠抑瘤率的影响于造模后第15天处死小鼠，剥离肿瘤组织，用滤纸吸干后称重。肿瘤抑制率(%)=〔(模型组平均瘤重－治疗组平均瘤重)/模型对照组平均瘤重〕×100%〔4〕。

1. 5. 2 caspase-3，8，9活性测定将肿瘤组织置于培养皿中，用手术剪剪碎成3 mm×3 mm左右的小块，加入冰冷的裂解缓冲液，冰上制备匀浆，匀浆后12 000 r/min离心20 min，取上清液，按照试剂盒操作要求检测肿瘤组织中caspase-3，8，9活性。

1. 5. 3细胞周期的测定瘤组织剪碎并研磨，采用200目过滤网过滤后制成单细胞悬液并用PBS漂洗，1 000 r/min离心后弃上清细胞重悬于预冷的75%乙醇中，－20℃固定24 h，常规PI染色后，采用流式细胞术检测细胞周期分布。

1. 6统计学分析实验结果以x ±s表示，采用SPSS15. 0软件行单因素方差分析、最小显著差法检验。

2　结果

2. 1天麻多糖对荷瘤鼠抑瘤率的影响与模型组〔(1. 05± 0. 21)g〕相比，各用药组瘤重明显减轻，CTX组瘤重〔(0. 43± 0. 11)g〕与模型组相比有极显著差异(P＜0. 01)，天麻多糖中、高剂量组与模型组相比瘤重减轻〔(0. 62±0. 15)、(0. 48± 0. 09)g〕(P＜0. 05)。低剂量天麻多糖组瘤重(0. 73±0. 16)g。CTX组抑瘤率为59%，高剂量天麻多糖抑瘤率为44. 7%，低、中剂量天麻多糖抑瘤率为20. 9%、31. 4%。

2. 2天麻多糖对荷瘤鼠caspase-3，8，9水平的影响与模型组比较，天麻多糖低剂量组明显升高casepase-3，8水平(P＜0. 05)，显著升高caspase-9合成(P＜0. 01);天麻多糖中、高剂量组及CTX组显著升高caspase-3，8，9水平，与模型组比较有极显著意义(P＜0. 01)。见表1。

2. 3天麻多糖对荷瘤鼠细胞周期的影响与模型组比较，天麻多糖中、高剂量组G0/G1期细胞百分数增加(P＜0. 05)，而CTX组G0/G1期细胞百分数显著降低(P＜0. 01)。天麻多糖各剂量组S期细胞的百分数与模型组比较无统计学意义(P＞0. 05)。天麻多糖中、高剂量组G2/M期细胞百分数下降(P＜0. 05)，环磷酰胺组与模型组比较，G2/M期细胞百分数显著升高(P＜0. 01)。见表2。

表1　天麻多糖对荷瘤鼠caspase-3，8，9水平的影响(x ±s，n=12)

表2　天麻多糖对荷瘤鼠细胞周期的影响(x±s，n=12)

3　讨论

本实验结果表明，天麻多糖可抑制H22移植瘤的生长且呈剂量依赖性。肿瘤细胞的死亡主要通过凋亡和坏死两个途径完成，在细胞凋亡过程中，caspase家族的激活起着关键作用。按不同caspase家族成员分子结构和激活顺序，通常将其分为细胞凋亡的起动因子(caspase-8/-9)和执行分子(caspase-3/-6/-7)。细胞凋亡中最关键的步骤是caspase-3的激活〔5〕，其中caspase-8和caspase-9是caspase-3的重要上游激活因子。caspase-8可通过死亡受体途径激活caspase-3，而caspase-9可通过线粒体途径活化caspase-3，活化后的caspase-3可诱导肿瘤细胞凋亡〔6，7〕。本文结果发现天麻多糖可显著升高caspase-3，8，9水平，说明天麻多糖诱导H22肝癌细胞凋亡的机制可能与促使细胞线粒体caspase级联反应途径活化有关。

完整的细胞周期包括DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)、DNA合成后期(G2期)、有丝分裂期(M期)和休眠期细胞(G0期)。在真核细胞一系列细胞周期检测点中，G1/S期检测点至关重要，细胞在该检测点时对各类生长因子、分裂原以及DNA损伤等复杂的细胞内外信号进行整合和传递，决定细胞进行分裂、发生凋亡或进入G0期，许多抗癌药物都是通过抑制此关键点而起调节作用〔8〕。流式细胞仪检测发现天麻多糖使机体G0/G1期肿瘤细胞百分比增加，G2/M期肿瘤细胞百分比下降，对S期细胞百分比影响不大，表明天麻多糖抑制肿瘤细胞增殖主要是通过阻止肿瘤细胞由G1期进入S期，防止其碱基被复制延缓细胞周期进程，使细胞的增殖速度减慢，达到抑制肿瘤细胞增殖的目的。CTX使G0/G1期和S期细胞百分比下降，G2/M期细胞百分比增加，说明其主要阻止了G2/M期细胞向G1期的转变。综上所述，天麻多糖可以抑制H22移植瘤的生长，这可能与天麻多糖阻止肿瘤细胞由G0/G1期进入S期，延缓细胞周期进程及促进肿瘤细胞凋亡有关。

4参考文献

1沈映君.中药药理学〔M〕．北京:人民卫生出版社，2000: 797-801．

2范玉奇，李文兰，王艳萍，等.天麻化学成分及药理性质研究的进展〔J〕．药品评价，2005; 2(4): 309-12.

3陈芳，杜娟，张秉华.天麻多糖的理化性质和药理活性研究〔J〕．现代中医药，2009; 29(6): 71-3.

4 Sun GP，Wang H，Xu SP，et al．Anti-tumor effects of paeonol in a HepA-hepatoma bearing mouse model via induction of tumor cell apoptosis and stimulation of IL-2 and TNF-α production〔J〕．Eur J Pharmacol，2008; 584: 246-52．

5 Clark RS，Kochanek PM，Watkins SC，et al．Caspase-3 mediated neuronal death after traumatic brain injury in rats〔J〕．J Neurochem，2000; 74(2): 740-53.

6 Fan TJ，Han LH，Cong RS，et al．Caspase family proteases and apoptosis 〔J〕．Acta Biochim Biophys Sin，2005; 37(11): 710-27.

7 Zeiss CJ，Neal J，Johnson EA. Caspase -3 in postnatal retinal development and degeneration〔J〕．Invest Ophthamol Vis Sci，2004; 45(3): 964-70．

8 Bartek J，Lukas J. Mammalian G1and S phase checkpoints in response to DNA damage〔J〕．Curr Opin Cell Biol，2001; 13(6): 738-47．

〔2014-09-04修回〕

(编辑郭菁)

The effects of Polysaccharide from Gastrodia Elata B1 on cell cycle and caspase proteins activity in H22 tumor bearing mice

LIU Xian-Hui，GUO Xiao-Na，ZHAN Jun-Ping，et al．
Henan Traditional Chinese Medicine Hospital，Zhengzhou 450002，Henan，China

【Abstract】Objective To observe the effects of Gastrodia Elata B1 Polysaccharide on cell cycle and caspase-3，8，9 activities in H22 tumor bearing mice．Methods Sixty mice were randomly divided into model，CTX，Gastrodia Elata B1 polysaccharide high，middle，low groups．Two weeks later，tumor weight of mice，tumor inhibition rate，caspase 3，8，9 activities and cell cycle were inspected respectively．Results Gastrodia Elata B1 Polysaccharide decreased tumor weight significantly，tumor inhibition rate in Gastrodia Elata B1 polysaccharide high group got 44．7%．Compared with those of model group，polysaccharide in middle and high groups increased caspase-3，8，9 activities and percent of G0/G1phase cells，decreased percent of G2/M phase cells．Conclusions Gastrodia Elata B1 polysaccharide has obvious anti-tumor effect on H22 tumor bearing mice．The mechanism might be related to regulating the cell cycle distribution，inhibiting the cell proliferation and activating the caspase system to induce apoptosis．

【Key words】Gastrodia Elata B1; Polysaccharide; Tumor

通讯作者:李晓冰(1980-)，女，讲师，博士，主要从事多糖免疫药理学研究。

基金项目:国家自然科学基金(No．81173177);中国博士后科学基金(2012M521412);河南中医学院2010博士基金(BSJJ2010-10)

〔文章编号〕1005-9202(2015)20-5681-02;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2015. 20. 001

〔文献标识码〕A

〔中图分类号〕R285. 5