以鸡鸭红细胞作血凝抑制指示剂检测鸭高致病性禽流感抗体的比较

钱昌银，程帮照，季晶晶，刘 华

（1.合肥市动物疫病预防控制中心，安徽合肥 230091；2.宣城市动物疫病预防与控制中心，安徽宣城 242000；3.滁州市动物疫病预防与控制中心，安徽滁州 239000；4.安徽省动物疫病预防与控制中心，安徽合肥 230091）

以鸡鸭红细胞作血凝抑制指示剂检测鸭高致病性禽流感抗体的比较

钱昌银1，程帮照2，季晶晶3，刘 华4

（1.合肥市动物疫病预防控制中心，安徽合肥 230091；2.宣城市动物疫病预防与控制中心，安徽宣城 242000；3.滁州市动物疫病预防与控制中心，安徽滁州 239000；4.安徽省动物疫病预防与控制中心，安徽合肥 230091）

[目的]分别以鸡和鸭红细胞（RBCs）作指示剂，检测鸭体内高致病性禽流感病毒血凝抑制（HI）抗体结果的一致性。[方法] 在对360份鸭血清进行H5亚型高致病性禽流感病毒（Re-6株）HI抗体检测时，分别使用1%鸡红细胞悬液和1%鸭红细胞悬液做指示剂，观察结果，计算阳性率、阳性一致性、阴性一致性、符合率，并进行Kappa检验。 [结果] 1%鸭红细胞悬液作指示剂的阳性率（76.7%）显著高于鸡的（5.8%），且有统计学意义（p<0.01）。两种方法共同检出13份抗体阳性和76份阴性，阳性一致性为61.9%（95%置信区间：41.1%-82.7%），阴性一致性为22.4%（95%置信区间：18.0%-26.9%），符合率24.7%（95%置信区间：20.3%-29.2%），Kappa值为-0.023（95%置信区间：-0.051-0.004）。[结论] 2种红细胞作指示剂的检测结果阳性率有显著差异，结果一致性强度为极差。

Kappa检验；鸭；高致病性禽流感；抗体；血凝抑制试验；红细胞

禽流感是由正粘病毒科A型流感病毒引起的一种禽类传染病，H5N1高致病性禽流感严重危害养禽业健康发展[1-3]。加强高致病性禽流感的疫苗接种和抗体监测是我国防控禽流感的重要举措。血凝（HA）和血凝抑制试验（HI）是目前国内外普遍采取的实验室检测禽流感抗体的方法[4]。国内常依照GB/T18936—2003进行[5]。实际操作中发现，对水禽进行抗体检测时如果使用鸡红细胞做指示细胞，常常存在非特异性凝集现象[4，6]。本文分别使用鸡和鸭红细胞作指示剂，对同一组鸭血清进行高致病性禽流感抗体检测，比较二者结果的一致性，为科学评价其免疫效果提供依据。

1 材料与方法

1.1 样品

高致病性禽流感疫苗（H5N1灭活苗，Re-6株）免疫鸭21天以后采集鸭血清，常规方法离心后-20℃保存。合肥、宣城、滁州3市各120份，由安徽省动物疫病预防与控制中心实验室提供。

1.2 主要试剂

禽流感病毒H5亚型（Re-6株）血凝抑制抗原购自哈尔滨维科生物技术开发公司，批号：2013001；禽流感病毒H5亚型（Re-6株）阳性血清购自哈尔滨维科生物技术开发公司，2013001；1%鸡红细胞悬液和1%鸭红细胞悬液，按GB/ T18936-2003方法配制，现配现用。

1.3 方法

按《高致病性禽流感诊断技术》（GB/ T18936—2003）进行HA及HI试验，测定禽流感病毒H5亚型（Re-6株）抗体效价。HI试验时使用不同家禽的红细胞悬液。使用1%鸡红细胞悬液的，进行HI试验前，血清经预处理[7]。即取25μL血清56℃水浴30min，取出加入25μL1%鸡红细胞悬液，轻摇后室温静置30min，800×g离心5min，取25μL上清做倍比稀释。使用1%鸭红细胞悬液的，进行HI试验时血清直接倍比稀释。然后，除最后一步加红细胞悬液不同外，其他步骤均同国标。

1.4 结果判定

农业部《高致病性禽流感防治技术规范》规定HI价≥24为阳性[8]。由于使用1%鸡红细胞悬液的，对鸭血清进行了预处理，相当于稀释了一倍，因此HI价≥23判为阳性，反之为阴性；而使用1%鸭红细胞悬液的，HI价≥24判为阳性，反之为阴性。

1.5 统计学方法

采用SPSS 20.0 统计学软件对2种指示剂检测的HI抗体阳性率进行χ2检验；采用Kappa 检验结果一致性。Kappa系数<0，极差；0～0.2，微弱；0.21～0.4，弱；0.41～0.6，中度；0.61～0.8，高度；0.81～1.0，极强[9]。

2 结果与分析

2.1 不同指示剂检测结果

360份鸭血清中，使用1%鸡红细胞悬液作指示剂，共检出禽流感病毒H5亚型（Re-6株）血凝抑制抗体21份阳性，阳性率5.8%；使用1%鸭红细胞悬液共检出276份阳性，阳性率76.7%，高于前者的结果（χ2= 239.94，p<0.01）。结果见表1。

表1 2种不同指示剂检测鸭H5亚型禽流感病毒（Re-6株）HI抗体结果

2.2 不同指示剂检测结果的一致性

使用两种红细胞的阳性结果一致性为61.9%（95%置信区间：41.1%～82.7%），阴性结果一致性为22.4%（95%置信区间：18.0%～26.9%），总体样本结果的一致率为24.7%（95%置信区间：20.3%～29.2%）。经SPSS20.0统计软件Kappa一致性检验，Kappa值为-0.023（95%置信区间：-0.051～0.004），结果两种指示剂的检测结果一致性强度为极差。

3 讨论

血凝和血凝抑制试验作为检测禽流感的常规方

法，是一种在基层临床应用中极易推广的检验、检疫手段与诊断方法。用鸡红细胞作指示剂检测水禽血清的HI抗体时，有些禽的血清可能对鸡红细胞产生非特异性凝集，有时能严重影响结果的判定[4，6，10，11]。鉴于此，世界动物卫生组织（OIE）建议用鸡红细胞对试验血清进行吸附，以除去非特异性凝集素，也可以用被检禽种的红细胞直接检测[7]。为此，用这两种方法对同一组鸭血清进行了检测并对结果进行了统计分析，结果二者一致性极差。在没有金标准的情况下，这表明用鸡、鸭红细胞作指示剂至少有一种试验方法的敏感性和特异性是比较差的。二者一致性差可能与本次试验使用的鸡或鸭的品种、鸡红细胞消除非特异性凝集素的效率等因素有关[4]，但有待进一步研究。

按农业部规定，H5亚型禽流感灭活疫苗免疫家禽21天后HI价≥24为免疫合格，禽群免疫抗体合格率≥70%为合格[12]。如果检测时用鸭红细胞作指示细胞，免疫效果能达到国家要求；但如果用鸡红细胞，合格率仅为5.8%，远远低于国家要求。因此，进行HI抗体检测时选用红细胞的种类，对禽群免疫抗体真实水平的评估有直接影响。

有试验表明，水禽HI抗体检测时使用被检禽种的红细胞比用鸡的红细胞效价要高2～4log2[13，14]。应用Kappa检验分析不同指示细胞检测HI抗体结果一致性，进一步证实了类似研究的结果，从而为科学选择指示细胞和评价免疫抗体效果提供了另一个重要参考依据。一般认为，检测鸭血清HI抗体时用鸭红细胞可消除非特异性凝集现象[15，16]，结合本次试验结果，建议在进行动物禽流感HI抗体检测时，使用同种动物的RBCs作指示细胞。

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A Comparison of HI Test for Detection of HPAIV Antibody in Ducks with Chicken and Duck Red Blood Cells as Indicators

Qian Changyin1，Cheng Bangzhao2，Ji Jingjing3，Liu Hua4
（1. Hefei Center for Animal Disease Control and Prevention，Hefei，Anhui 230091；2. Xuancheng Center for animal Disease Control and Prevention，Xuancheng，Anhui 242000；3.Chuzhou Center for Animal Disease Control and Prevention，Chuzhou，Anhui 239000；4. Anhui Center for Animal Disease Control and Prevention，Hefei，Anhui 230091）

To compare the consistency of the results of antibody against highly pathogenic avian influenza virus （HPAIV）in ducks by hemagglutination inhibition test with chicken or duck red blood cell （RBC） as indicators，360 duck serum samples were tested for H5 subtype HPAIV （Re-6 strain） antibody by HI test with 1% chicken and duck RBCs as indicators respectively. Test results were observed，the positive rate，the positive and negative consistence，the coincidence rate were calculated，and consistence was determined by Kappa test. The positive rate （76.7%） of HI antibody with 1% duck RBC was higher than that with chicken RBC（5.8%），suggesting a statistically significant difference（p<0.01）. 13 positive and 76 negative were detected with the two indicators together with a positive consistence of 61.9%（95%CI∶741.1%-82.7%） and a negative consistence of 22.4%（95% CI∶18.0%-26.9%），and a coincidence of 24.7%（95%CI∶ 20.3%-29.2%）.The Kappa value was -0.023（95%CI∶ -0.051-0.004）. The results showed that there was a significant difference between the two positive rates of the HI tests with chicken or duck RBC as indicators，and a poor consistency between them.

Kappa test；duck；high pathogenic avian influenza（HPAI）；antibody；hemagglutination inhibition（HI）test；red-blood cell （RBC）

S858.28

B

1005-944X（2015）04-0060-03

刘 华